8.4.3. Биохимический метод диагностики HP.

Еще в начале века было обнаружено, что фермент уреаза присутствует в желудке млекопитающих, но в то время ее происхождение и функции были неизвестны. Всередине столетия Фитцджеральд и Мерфи показали, что уреаза имеется у животных самых разных видов — от амфибий до млекопитающих. Более того, им удалось установить, что наибольшее количество фермента находится на поверхностиэпителиальных клеток, в области расположения париетальных клеток, а также вдне пептических язв. Поэтому они предположили, что фермент имеет защитнуюфункцию и его основной точкой приложения является нейтрализация HCL. Однако спустя 4 года после опубликования результатов их работы, было обнаружено,что активность уреазы у кошек связана с жизнедеятельностью бактерий(39). А после того, когда впервые было установлено, что HP продуцирует в большом количестве уреазу (40), стало ясно, что уреаза в желудке человека также имеет бактериальное происхождение. Позже английские исследователи показали, что продукция уреазы бактерией столь велика, что позволяет первой накапливаться в тканижелудка,- это дало возможность использовать методы обнаружения уреазы непосредственно в биоптатах слизистой оболочки желудка (41).

До настоящего времени было предложено много различных тестов для обнаружения уреазы в слизистой оболочке желудка. Прежде чем обсудить их достоинства и недостатки, видимо, следует изложить принцип, который положен в основу всех биохимических тестов. При гидролизе мочевины под действием уреазы происходит следующее:

уреаза

» 2NH4+ + НСО3

NH2

C = 0 2H20 + H + NH2

Получающийся в результате ион аммония приводит к сильному увеличению pH среды, что можно зафиксировать с помощью индикатора, а следовательно и визуально, по изменению окрашивания среды.

Аналогичный подход используется в микробиологии для определения уреазной активности у бактерий, при котором исследуется взвесь бактерий, или исследуются свойства чистой культуры. Для таких целей используется жидкая среда Хри-стенсена, следующего состава: мочевина 20 г/л, фенол рот 0,012 г/л, КН2Р04 2г/л, пептон 1 г/л, хлорид натрия — 5 г/л, глюкоза — 10 г/л. Индикатор фенол-рот имеет желтый цвет при pH 6,8, и ярко малиновый при pH 8,4. Именно этасреда и была впервые применена для определения HP в биоптатах слизистой оболочки желудка (41), она до настоящего времени является основой для создания более точных, удобных и совершенных тестов.

Существует несколько путей повышения эффективности подобной среды. Прежде всего, совершенствование большинства тестов шло по пути введения в состав среды различных антибактериальных добавок, для уменьшения ложноположительных результатов теста. Другой путь для ускорения получения результата(большинство тестов сегодня дают ответ в течение 24 часов) сводился к исключению из среды буфера, что позволяло получать более резкий сдвиг pH и это приводило к ускорению изменения окрашивания среды, но чувствительность при такоймодификации оказывается существенно ниже. Другие исследователи пыталисьувеличить эффективность среды Христенсена путем помещения ее вместе с био-птатом в термостат и получали результат при температуре 37°С спустя один часпосле начала опыта. Специфичность такой методики достигала 100%, а чувствительность — 67%, однако спустя 24 часа от начала инкубации за счет ложноположительных результатов специфичность снизилась до 74%, а чувствительностьвозрасла до 83% (42). В целом при таком усовершенствовании нарушается принцип на котором основаны все биохимические способы определения HP. В био-птате определяется только тканевая уреаза, то есть фермент, который накопленв тканях в результате жизнедеятельности бактерии в желудке. Когда биоптат берется из желудка, его температура понижается до температуры окружающей среды, действует О атмосферного воздуха и прочие неблагоприятные факторы, которые прекращают жизнедеятельность бактерии, а кроме того антибактериаль

ные добавки, присутствующие в большинстве современных тестов просто уничтожают любые бактерии, находящиеся в биоптате. Если же подвергать инкубации неселективную среду Христенсена, содержащую достаточно большое количество питательных веществ, то, естественно, другие бактерии, вырабатывающие уреазу смогут изменить результат теста. Ведь в среду вносится не чистая культура, а биоптат из слизистой оболочки желудка, который может содержать различную микрофлору.

Основой разработки уреазных тестов для диагностики HP является тот факт, что никакая другая бактерия, кроме HP не способна продуцировать уреазу в условиях желудка в таких количествах, чтобы она накапливалась в его слизистой оболочке. Поэтому высокочувствительными и специфичными могут быть методы,определяющие исключительно тканевую уреазу, а не бактериальную, то есть методы «холодные»;, работающие при комнатной температуре, содержащие бактерицидные добавки, уничтожающие любую микрофлору в биоптате.

Кроме всего прочего, существует ряд чисто химических закономерностей, не имеющих к бактерии никакого отношения. Так, оптимум pH для уреазы составляет 8,2 (43), следовательно pH среды, в которую помещается биоптат, должнабыть близкой этому значению и тогда, очевидно, повысится скорость срабатывания теста и его чувствительность. Но в этом случае необходимо сменить индикатор, например, на тимол-блау, с большим значением pH перехода.

Идеальная концентрация субстрата в ферментативных реакциях должна превышать в 50-100 раз К фермента (показатель сродства фермента к субстрату), поскольку, если субстрат находится в избытке, то скорость реакции зависит только от активности самого фермента. Уреаза HP имеет значение Км равное 0,32 г/л(8мМ) (43), тогда идеальная концентрация мочевины в тесте должна быть в пределах 16-32 г/л. Превышение этого значения может приводить к подавлению активности фермента.

Существует также ряд других требований, которым должны отвечать подобные тесты.

Подавляющее большинство существующих тестов имеет ряд недостатков, из которых основным является их низкая стабильность. Скажем, среда Христенсенаможет храниться в холодильнике в стерильно укупоренной таре в течение максимум 1 месяца, широко известный CLO-test (44) должен так же храниться в холодильнике, ряд других тестов вообще не допускают хранения и требуют приготовления и использования ex tempora.

В связи с этим нами был разработан «Campy-test»; (37,38), который не уступает по основным показателям лучшим из тестов, но кроме этого, имеет срок хранения при комнатной температуре более года, что очень важно, поскольку позволяет производить такой тест промышленным способом без особых затруднений.

Сейчас он выпускается промышленностью. В отличие от других в нем использован плотный носитель среды, что упрощает работу с ним, он используется при комнатной температуре и имеет в своем составе бактерицидную добавку. Внешний вид теста показан на Рис. 8.10.

При оценке уреазных тестов основными показателями являются чувствительность и специфичность, которые даются в процентах от результатов, полученных при исследовании биоптатов того же больного двумя другими «эталонными»; методами морфологическим и микробиологическим. Сравнивая наиболее известныетесты по различным параметрам,мы представили обобщенные данные в Таблице8.2.

Как видно из приведенных в таблице данных все указанные тесты обладают примерно одинаковой чувствительностью и специфичностью, поэтому выбор того или иного теста, очевидно, определяется его стоимостью, временем за котороеможет быть получен результат, простотой изготовления и использования.

По скорости действия теста самый быстрый 1 минутный тест, который приготовляется «ех tempora»; в эндоскопическом кабинете и состоит из 1 мл 10% раствора мочевины в деионизированной дистиллированой воде, в который добавлено 2 капли 1% раствора фенол-рот (45). Тем не менее, приемущество во времени, даваемое этим тестом, весьма спорное, поскольку все другие тесты дают в течение первого часа более 70% положительных реакций, а время которое уйдет наежедневное приготовление раствора прямо в эндоскопическом кабинете, дополнительный персонал и оборудование, наврядли даст выигрыш как во времени, таки в средствах.

Безусловно, наиболее удобны тесты, выпускаемые промышленным способом, такие как ,,CLO-test“, ,,Campy-test“, поскольку они не требуют времени на приготовление, просты в использовании, но для них существенен вопрос стоимости.Например, в Великобритании CLO-test на одно исследование стоит около 2 фунтов стерлингов (46).

Преимуществами уреазных тестов являются: простота проведения, получение результата быстрее чем микробиологическим или морфологическим методом,подавляющее большинство современных уреазных тестов позволяет врачу сделать соответствующие назначения практически сразу после исследования и, соответственно, исключить дополнительное посещение поликлиники больным. Все тесты независимо от способа их приготовления несравненно дешевле гистологического и микробиологического исследований.

К недостаткам следует отнести то обстоятельство, что не смотря на высокую чувствительность у ряда больных HP не диагностируются. Это связано с тем, чтоиногда в данном биоптате бактерии отсутствуют. Но такой же недостатоксвойственен и морфологическому и микробиологическому методам, поскольку

для исследования они используют тот же биоптат.

Не смотря на указанные недостатки для клинических целей методика вполне приемлима (46).

Ряд исследователей обнаружили корреляцию между скоростью изменения окрашивания уреазного теста и обсемененностью слизистой оболочки на гистологическом препарате (47,48), другие же, напротив, подтвердить это не смогли(44,48). Очевидно такое противоречие связано со способом оценки метода. Мы вчастности, провели подобное сравнение следующим образом: сразу после взятиябиоптата делали мазок на стекле для последующего цитологического исследования, а затем этот же биоптат помещали в ,,Campy-test“, в результате мы получили прямую зависимость — чем больше было бактерий в поле зрения, тем быстреенаступало изменение окрашивания теста.

Таким образом, уреазные методы являются простыми, удобными, позволяющими с большой точностью определять наличие бактерии HP в биоптатах слизистой оболочки желудка, они также косвенно позволяют судить о степени обсеме-ненности ее бактерией.

Хронический гастрит, Л.И. Аруин, 1993