p>РОЗДІЛ 12. ГОЛОВНИЙ КОМПЛЕКС

ГІСТОСУМІСНОСТІ: СТРУКТУРА і ФУНКЦІЇ

Учення про ГКГ є стрижневим у фундаментальній і прикладній імунології. Вище вже неодноразово згадувалося про молекули ГКГ, зокрема під час опису особливостей презентації чужорідного матеріалу для розпізнавання Т-лімфоцитам при розвитку імунної відповіді. Роль молекул ГКГ надзвичайно важлива. Набір цих молекул для кожної людини абсолютно індивідуальний.

Перші роботи, що свідчать про існування у ссавців генів, які детермінують вираженість трансплантаційної реакції відторгнення, з’явилися понад 40 років тому, із початком активного пересаджування органів. Згодом ця група генів одержала назву «головний комплекс гістосумісності» (major histocompatibility complex — МНС). Самою назвою було підкреслено їх визначальну роль у розвитку і рансплантаційного імунітету. У людини цей комплекс генів одержав назву системи HLA (human leukocyte antigen). Таким чином, абревіатури ГКГ, МНС і HLA для людини є синонімами позначення і оловного комплексу гістосумісності.

Дійсно, донедавна при вивченні проблем, пов’язаних з анти-і єнами системи HLA (трансплантаційними, або тканинними, антигенами), керувалися переважно їх очевидним практичним іначенням у пересаджуванні органів, насамперед нирки. Первинна біологічна функція трансплантаційних антигенів була невідома. Однак досягнення останніх років у дослідженні генетичної структури і біологічної ролі ГКГ дозволили визначити принаймні дві основні його

функції, шо мають загальнобіологічне значення. До них належать:

1) роль трансплантаційних антигенів у міжклітинних взаємодіях під час реалізації імунної відповіді; 2) функція НLA-регіону, пов’язана з імунологічною реактивністю організму в цілому. У першому випадку мова йде про те, що молекули ГКГ є тими структурами, за допомогою яких здійснюється презентація чужорідного антигенного матеріалу для наступного розпізнавання антигенрозпізнавальним Т-клітинним рецептором. У другому випадку мова йде про існування в HLA-регіоні спеціального гена імунної відповіді (Іг — imunne response), наявність якого визначає здатність даного організму розвивати імунну відповідь на конкретний антиген; ця сама функція НLA-регіону пов’язана зі схильністю до низки захворювань.

Початком вивчення антигенів гістосумісності людини можна вважати працю G. Dausset (1957), у якій було описано перший антиген гістосумісності людини, названий МАС (нині це HLA-A2).

Деякі дослідники називають антигени ГКГ «імунним паспортом, групою білої крові», за допомогою яких імунна система здатна відрізняти «своє» — self від «чужого» — non-self. Індивідуальний набір і властивості молекул ГКГ багато в чому визначають силу імунної відповіді конкретної людини на конкретний антиген.

Помітивши, шо клітини гомозиготних близнюків реагують із набором тест-сироваток однаково, а гетерозиготних — по-різному,

G. Dausset висловив припущення, що згодом підтвердилося, про генетичну детермінованість антигенів гістосумісності: тобто про те, що кожний із генів, які входять у НLA-комплекс, має своє представництво у вигляді антигену гістосумісності, експресує на мембрані клітини.

На сьогодні ГКГ (HLA) людини є одним із найбільш вивчених і водночас найскладніших генетичних структур у геномі людини.

Позначення HLA-специфічностей включає три компоненти:

1) абревіатуру всієї системи; 2) локус, що містить дану специфічність;

3) номер антигену (наприклад HLA-B12). У тому разі, коли генетична позиція антигену ще недостатньо ясна або недостатньо уточнена, перед його порядковим номером ставлять символ «w» (workshop).

На мал. 10 наведено дещо спрощену схему системи HLA людини. Встановлено, що гени HLA-системи розташовані на короткому плечі 6-ї хромосоми. Усіх їх поділено на три групи: гени гістосумісності класу І, класу II і класу III; також згруповані і молекули (антигени), контрольовані цими генами.

Нині гени системи HLA-класу І включають локуси В, С, Е, A, G, F (у напрямку до теломери). Частина з них — локуси В, С

Центромера Теломера

В С Е A G F

Мал. 10. Схематичне зображення генного комплексу HLA на С6 хромосомі

й А — відносять до так званих класичних, шо кодують традиційні трансплантаційні антигени. Що стосується недавно відкритих локусів Е, G, F, то біологічна функція їх самих і їх продуктів уточнюється. Можливо, деякі з них беруть участь у презентації антигену для розпізнавання інтраепітеліальними Т-лімфоцитами-кілерами, які несуть у-, а-ланцюги в антигенрозпізнавальному рецепторі; інші визначають взаємовідносини в системі «мати—плід» (наприклад антигени локусу G).

У нормі «класичні» антигени системи HLA класу І присутні на всіх ядерних клітинах, розрізняючись лише за ступенем інтенсивності їх експресії. Доведено найнижчий вміст їх на міокардіоцитах, кісткових м’язах, ендотелії рогівки; не встановлено їх присутність на нитках трофобласту. Ступінь вираженості антигенів системи HLA як І, так і II класу — непостійний і залежить від впливу насамперед так званих ендогенних факторів модифікації імунної відповіді, до яких відносять інтерлейкіни, інтерферони, ПНФ, простагландини тощо.

Однією з найважливіших характеристик генів системи HLA є їх різноманітність і поліморфізм, тобто існування в межах кожного локусу великої кількості різних специфічностей HLA-генів (або множинних алельних варіантів), що різняться між собою за амінокислотними послідовностями, які входять у варіабельну ділянку ДНК, що визначає їх поліморфізм. Описано понад 40 специфічностей у локусі А, більше ніж 60 специфічностей у локусі В та приблизно 20 — у локусі С (R. Lechler, 1994). Крім того, показано, що деякі специфічності (гени) мають по декілька алельних варіантів. Так, наприклад, НЬА-А2-специфічність має 12 алелів, В35 — 6, а

В27 — 7 апелів. Наявність алельного поліморфізму HLA-молекул лежить в основі суворої індивідуалізації набору трансплантаційних антигенів у кожної конкретної людини, роблячи її неповторною в цьому плані.

Дуже важливим етапом у розвитку вчення про систему HLA і в розумінні функції молекул HLA класу І стали праці, у яких було описано їх тонку будову.

На мал. 11 подано схематичне зображення структури молекули (антигену) HLA класу І (І. Roitt, 1994). За сучасними уявленнями, молекула HLA класу І є гетеродимером, що складається з важкого а-поліпептидного ланцюга і нековалентно зв’язаного з ним легкого р-поліпептидного ланцюга.

а-Ланцюги молекул класу І містять приблизно 340 амінокислотних залишків, що формують три позаклітинних домени (а,, а2, а3), одну трансмембранну частину і внутрішньоцитоплазматичний «хвіст». Вони

Пептид, умішений у пептидзв’язувальну борозенку

COOH (внутрішньо-плазматичний “хвіст”)

Мал. 11. Схематичне відтворення молекули (антигену) HLA І класу

(пояснення в тексті)

кодуються генами локусів А, В й С комплексу HLA, розташованого на 6-й хромосомі, і, як уже згадувалося, є високополіморфними. р-Ланцюг молекули класу І — це р2-мікроглобулін, який складається з позаклітинного домену, що включає 100 амінокислотних залишків, він кодується геном, розташованим на 15-й хромосомі, і є неполіморфним.

Серія праць, створених Р. Bjorkman та співавторами (1987), дала змогу зрозуміти природу просторової взаємодії HLA-молекул і антигенних пептидів.

З’ясували, що взаємне розташування а,- і а2-доменів у молекулі HLA класу І створює «жолоб», «кишеню», у формуванні якої беруть участь дві а-спіралі — «стіни» і антипаралельні р-складки — «дно»; ця структура одержала назву «пептидзв’язувальна борозна». Певна амінокислотна послідовність цієї борозни служить своєрідним «якорем» утримання в ній пептиду. Саме в такий спосіб НІ А-молекула класу І презентує специфічний пептид для його подальшого розпізнавання а- і р-ланцюгами Т-клітинного антигенрозпізнавального рецептора.

Як згадувалося вище, пептид є процесованим антигеном (чужорідний або власний), що складається з невеликої кількості амінокислотних залишків. Так званий лінійний пептид, розміщений у пептидзв’язувальній борозні молекули НІА класу І, складається з 4—9 амінокислотних залишків. Трохи більше (до 20) містять пептиди, розташовані в «борознах» молекул класу II. По суті пептид — це антигенна детермінанта, епітоп. Складний антиген може містити сотні пептидів.

Як же утворюється пептид, як він потрапляє в пептидзв’язуваль-ну борозну молекули гістосумісності класу І і як вона з’являється на поверхні клітини? Це стало зрозумілим після виявлення двох нових локусів — LMP і ТАР, віднесених до класу II (див. мал. 10).

Гени локусу LMP кодують великий пептидний комплекс, названий протеасомою. Протеасома є внутрішньоклітинним комплексом, залученим до протеолізу цитозольних білків, що забезпечує продукцію ендогенних пептидів (мал. 12).

У свою чергу ці пептиди за допомогою трансмембранних білків, контрольованих генами локусу ТАР, надходять до ендоплазматичної сітки і там «завантажуються» в антигензв’язувальну борозну антигенів системи НІА класу І, потім транспортуються на поверхню клітини і далі презентуються для розпізнавання попередникам Т-лімфоцитів-кілерів (супресорів; С08+-клітини). Важливо пам’ятати, що до антигенів, які піддаються впливу протеасом, належать не лише власні цитозольні білки, а й продукти багатьох вірусних, бактеріальних або

Молекула HLA класу І разом з пептидом на поверхні клітини

Цитозоль Ендогенні білки

Транспортні білки (TAP-1, ТАР-2) Пептиди

А

Протеосомні ‘ У ферменти

‘Утворення ендогенних пептидів за допомогою ^протеосомних ферментів * *

Загрузка пептиду й транспорт через комплекс Гольджі на мембрану клітини

/ Ендоплазматична сітка

Формування молекули HLA класу 1

Синтез молекули HLA класу 1

Мал. 12. Схема механізму презентації антигену за допомогою молекули HLA класу І (пояснення в тексті)

* У цитозолі крім ендогенних формуються також деякі екзогенні пептиди, зокрема вірусні.

протозойних патогенів, що індукують розвиток клітинної відповіді і дозрівання Т-лімфоцитів-кілерів (С08+-клітини).

Таким чином, пептиди, презентовані молекулами HLA класу І, несуть інформацію про всі цитозольні ендогенні білки як нормальні, так і змінені, або в результаті мутації, або внаслідок модифікації вірусами, а також іншими внутрішньоклітинними паразитами. Оскільки «класичні» антигени ГКГ класу І наявні, як уже згадувалося, на всіх клітинах організму, стає зрозумілим, наскільки важливий подібний цензорний механізм за зміненими клітинами, що індукують активацію цитотоксичних Т-лімфоцитів-кілерів (С08+-клітини).

Гени системи HLA класу II (див. мал. 10) розташовані безпосередньо поблизу центромери і включають декілька локусів, частину з яких — DR, DP, DQ — можна віднести до «класичних», трансплантаційних або таких, що беруть безпосередню участь у презентації

чужорідного антигену під час його розпізнавання; інші виконують хоч і надзвичайно важливу, але все ж допоміжну функцію.

Антигени, кодовані генами системи HLA класу II локусів DR, DP і DQ, експресуються на противагу молекулам HLA класу І не настільки широко. їх виявлено в нормі лише на В-лімфоцитах, макрофагах і дендритних клітинах (тобто на клітинах, здатних презентувати антиген). У разі впливу таких цитокінів, як у-ІНФ, молекули HLA класу II можуть експресуватися і на інших клітинах, наприклад Т-лімфоцитах, ендотеліальних і епітеліальних клітинах.

Молекули HLA класу II (мал. 13) дещо відрізняються за структурою від молекул HLA класу І. Будучи гетеродимерами, а- і р-ланцюги складаються приблизно з 230 амінокислотних залишків, кожний з який формує два позаклітинних домени (а, і а2, Р] і Р2), трансмембранну частину і внутрішньоплазматичний «хвіст»; р-ланцюг є високополіморфним. Молекули HLA класу II також мають пептидзв’язувальну борозну, у формуванні якої беруть участь порівно а,- і Pj-домени а- і р-поліпептидних ланцюгів: їх а-спіралі («стіни» борозни) і антипаралельні р-складки («дно» борозни).

Пептид, умішений у пептид-зв’язувальну борозну

плазматичний “хвіст"

Мал. 13. Схематичне відтворення молекули (антигену) НІАII класу

(пояснення в тексті)

У пептидзв’язувальних борознах антигенів системи HLA класу II також є пептиди, але в основі їх утворення (продукції) лежить принципово інший внутрішньоклітинний механізм. У цьому разі пептиди надходять з екзогенних антигенів, поглинених АПК за допомогою, наприклад ендоцитозу (мал. 14).

Після ендоцитозу чужорідний антиген піддається деградації (протеолізу) у ранніх і пізніх ендосомах (лізосомах), у результаті чого утворюються пептиди. Однак «завантаження» цих пептидів у пептидзв’язувальну борозну молекул HLA класу II відбувається не в ендоплазматичній сітці. Справа в тому, що хоча збирання молекул HLA класу II і відбувається в ендоплазматичній сітці, але в цьому компартменті клітини зазначені молекули мають додатковий ланцюг, який має назву інваріантний ланцюг (ІЛ), що ніби «прикриває» собою пептидзв’язувальну борозну. Такий комплекс — молекули HLA класу II + ІЛ — транспортується через комплекс Гольджі в ендосомний компартмент клітини, де міститься пептид, що утворився з чужорідного антигену. Тут під впливом катепсинів В і D відбувається руйнування ІЛ і «завантаження» пептидів у пептидзв’язувальну борозну, що відкрилася. На наступному етапі комплекс, що утворився, — молекула HLA класу II + пептид —

Транспорт молекули HLA класу II разом з пептидом на поверхню АПК для наступної презентації

Втрати інваріантного ланцюга і загрузка пептиду в пептидзв’язувальну борозну молекули HLA класу II, що звільнилася

Транспорт молекули HLA класу II з ІЛ в

ендосомно-.п юсомний компартмент клітини

Фагоцитоз екзогенного антигену Ґ

Процесинг антигену лізосомними ферментами (утворення екзогенних пептидів)

Формування молекули HLA класу II з ІЛ

Синтез молекули HLA класу II

Мал. 14. Схема механізму презентації антигену за допомогою молекули HLA класу II

(пояснення в тексті)

транспортується на поверхню клітини і презентується для розпізнавання Т-лімфоцитам-хелперам (СЮ4+-клітинам). Активовані в такий спосіб Т-лімфоцити-хелпери в свою чергу беруть участь у реалізації імунної відповіді.

Говорячи про основну роль молекул HLA класу І і II у реалізації імунної відповіді, варто підкреслити їх необхідність для антигенної активації Т-клітин. На відміну від В-клітин, що безпосередньо розпізнають антиген за рахунок своїх імуноглобулінових рецепторів, Т-клітини можуть розпізнавати його лише тоді, коли антиген у вигляді пептиду експресовано на клітинній мембрані в комплексі з власного HLA-молекулою — феномен HLA-рестрикції (обмеження розпізнавання антигенних пептидів молекулами HLA; мал. 15).

Установлено, що субпопуляція Т-лімфоцитів-хелперів (CD4+-клітини) розпізнає чужорідний пептид, презентований молекулами HLA класу II, а субпопуляція Т-лімфоцитів-кілерів (супресорів; С08+-клітини) розпізнає пептид, презентований молекулами HLA класу І, тому говорять, що функція Т-хелперів обмежена (рестриктована) молекулами HLA класу II, а функція Т-кілерів (супресорів) — молекулами HLA класу І. Доведено, що структури CD4 і CD8, наявні на Т-хелперах і Т-кілерах (супресорах) відповідно,

Мал. 15. Феномен HLA-рестрикції: АГРР — антигенрозпізнавальний рецептор

» «-1765

є додатковими адгезивними молекулами, що стабілізують приєднання Т-клітин-хелперів і кілерів до АПК за допомогою специфічної взаємодії з неполіморфними частинами відповідно до молекул HLA класу II (р2-Домен) і класу І (а3-домен). Вони специфічно розпізнають аутологічні молекули ГКГ і ніби «утримують» разом АПК і Т-лімфоцит, забезпечуючи тим самим достатній контакт клітин у процесі розпізнавання. Крім того, CD4 і CD8 молекули належать до так званих костимуляційних молекул, які сприяють трансдукції сигналу всередину Т-лімфоцита. Ще одним важливим костимуляційним сигналом для активації Т-лімфоцита є взаємодія його рецептора CD28 із білками на поверхні АПК із родини молекул CD80. У процесі цієї взаємодії відбувається передача сигналу всередину Т-лімфоцита, у результаті чого відбувається його активація. Без костимуляційних сигналів активація Т-лімфоцитів не настане; можливою є його загибель за механізмами апоптозу.

У табл. 5 наведено коротку порівняльну характеристику антигенів (молекул) системи HLA класів І і II.

Важливою є також можливість зміни ступеня експресії молекул HLA. Встановлено, що молекули класу II, наявні в нормі тільки на АПК, можуть індукуватися на багатьох (якщо не на всіх) клітинах під впливом інкубації з у-ІНФ, що включає транскрипцію генів класу II в цих клітинах. Крім того, обробка у-ІНФ клітин, на яких звичайно виявляють молекули HLA класу II, посилюватиме їх експресію, тоді як простагландин Е буде знижувати цей ефект. Звідси випливає, що кількісна і якісна експресія молекул HLA класів І і II може критично залежати від різних регуляторних механізмів, здатних її як

Таблиця 5. Коротка характеристика класичних антигенів системи HLA класів І і II

Характеристика

Клас І •

КласІІ

Генетичні локуси

HLA-А, В, С

HLA — DP, DQ, DR

Розподіл у тканинах

Усі ядровмісні клітини

В-Лімфоцити, моноцити, макрофаги, дендритні клітини, активовані Т-лімфоцити, епітеліальні й ендотеліальні клітини

Участь у презентації пептидів для Т-клітин

Для Т-кілерів (CD8+)

Для Т-хелперів (CD4+)

Зв’язування з поверхневими молекулами Т-клітин

3 молекулою CD8

3 молекулою CD4

посилювати, так і послаблювати. Ця обставина має важливе значення. Так, клітини, що є в нормі клас-ll-негативними, у присутності у-ІНФ (продукуються активованими Т-клітинами-хелперами) можуть ставати клас-ІІ-позитивними і набувати здатності індукувати антигенспецифічну відповідь. Оскільки ступінь Т-клітинної активації (до визначеної межі) прямо пропорційний концентрації HLA-молекул, кількісні варіації в експресії молекул HLA класів І і II можуть чинити імунорегуляторний вплив, посилюючи (або послаблюючи) імунну відповідь.

Гени системи HLA класу III (див. мал. 10) займають на 6-й хромосомі проміжне положення між генами класів І і II. Вони не кодують класичні антигени гістосумісності, але їх продукти виконують цілу низку найважливіших біологічних функцій.

Одним із генів системи HLA класу III, що привертають найбільшу увагу, є ген CYR2I, основна функція якого — контроль за активністю ферментів цитохрому Р450. Дефект цього гена призводить до розвитку синдрому конгенетальної адреналової гіперплазії, частота якого в популяції європеоїдів становить 1/10 000. «Нормальну» функцію ферментів кодує ген CYR21; тоді як CYR21P є псевдогеном.

Гени С4 (С4А і С4.В) кодують 4-й компонент комплементу.

У популяції європеоїдів наявність «С4А нульового алелю» здебільшого асоційована зі схильністю до системного червоного вовчака й іншої аутоімунної патології. Що стосується асоціації системного червоного вовчака з HLA-гаплотипом (сукупність генів, розташованих на одній хромосомі) у цілому, то найсильніший зв’язок зі схильністю до системного червоного вовчака встановлено для гаплотипу HLA-AI, -В8, -Cw4, -DR3.

Ген В (BJ) функціонує значною мірою разом із геном С2, беручи участь у «запуску» альтернативного шляху активації. Дефіцит гена В описано тільки в гетерозиготі. У гомозиготі дефіцит цього гена не описано і він, мабуть, має летальний характер.

Дефіцит С2 є найчастішою формою недостатності системи комплементу в людини (частота відсутності С2 в гомозиготі 1:10 000). У 40 % хворих на системний червоний вовчак виявлено дефіцит С2.

Наступним після локусу С2 в бік від центромери є локус генів теплового шоку 70 (HSP70). Білкові продукти цих генів виконують протективну функцію під час розвитку так званого клітинного стресу (підвищення температури тіла, зміна pH і осмотичності внутрішньо- і позаклітинного середовища). Не виключено, що продукти цих генів можуть зумовлювати асоціацію певних алельних варіантів HLA-генів із захворюваннями людини.

Крайнім у бік теломери серед генів системи HLA класу III є локус ПНФ (TNF ), який складається з двох генів — А і В, що кодують ПНФ-а й ПНФ-р. Обидва білки секретуються активованими макрофагами і Т-лімфоцитами і справляють плейотропну дію на різні типи клітин, включаючи різні субпопуляції лімфоцитів, нейтрофіли й ендотеліоцити судин.

Зазначені механізми дії білків ПНФ, а також їх вплив на запальний процес, опосередкований ними цитолітичний і цитотоксичний ефект проти ракових клітин забезпечують найважливішу біологічну функцію ПНФ. Крім цього, білки ПНФ беруть участь у регуляції експресії антигенів HLA класу І на ендотелії судин, що свідчить про участь ПНФ у розвитку аутоімунної патології і реакції відторгнення трансплантації.

HLA-гени успадковуються за кодомінантним типом, що означає однаковий прояв у гібридів алоантигенів, зумовлених обома батьківськими алелями даного локусу. Оскільки кожний індивідуум одержує від своїх батьків по одній хромосомі, у людини є два гаплотипи, що в сукупності формують генотип.

Антигени, виявлені під час вивчення клітин конкретної людини, формують її фенотип; таке лабораторне обстеження називають фенотипуванням. На відміну від фенотипу, в генотипі відома послідовність розташування генів на хромосомі. Генотип (два гаплотипи) може бути визначений за допомогою родинних досліджень, під час яких виявляють фенотипи батьків і дітей (рідні сестри і брати — сибси). Таким чином, визначаючи фенотипи членів родини, можна встановити гаплотипи.

Для вирішення важливих питань, пов’язаних із вивченням ГКГ людини, організовують і проводять Міжнародні робочі наради (Міжнародні workshops). Рішення про упорядкування специфічностей, особливо про скасування «W», приймають у разі кореляції всіх даних робочої наради (результатів досліджень локальних лабораторій, з одного боку, і даних, отриманих у результаті остаточного комп’ютерного аналізу, — з іншого).

Експерименти на тваринах, а також результати, отримані насамперед після пересаджування алогенних органів, показали, що в цілому ссавців за здатністю розвивати імунну відповідь на конкретний антиген можна поділити умовно на три групи: 1) респондери (to respond — відповідати), що розвивають сильну імунну реакцію;

2) нонреспондери — реагують на той самий антиген слабко; 3) частина популяції, що реагує середньо. Було висловлено припущення про існування гена імунної відповіді (Ir — immune response), що визначає індивідуальну специфіку імунного реагування. Дійсно, у 1972 р. McDevitt і співавтори повідомили про те, що їм удалося картувати ген

імунної відповіді в мишей саме в ділянці ГКГ. Спроби виявити Іг-ген у людини доки що безуспішні. Водночас, досягнення фундаментальної імунології останніх років дозволили сформувати уявлення про Іг-ген у людини як про деяку інтегральну функцію, у якій беруть участь «головні діючі особи» процесу розпізнавання: чужорідний пептид, молекули HLA класів І і II і антигенрозпізнавальний Т-клітинний рецептор. R. Lechler (1994) описує участь згаданих структур у реалізації інтегральної функції імунного розпізнавання в такий спосіб:

1. По-перше, необхідно, щоб АПК могла «зробити» оптимальну кількість пептидів із чужорідного антигенного матеріалу, а її пептид-зв’язувальні борозни могли зв’язати їх; цей етап названо селекцією антигенних детермінант.

2. По-друге, необхідно, щоб імунна система конкретної людини мала достатній репертуар Т-лімфоцитів із антигенрозпізнавальним рецептором, здатним розпізнати чужорідний пептид. Якщо ж такі Т-лімфоцити відсутні (тобто мають місце «дірки» у репертуарі Т-лімфоцитів), то створюються умови, за яких імунна система не здатна розпізнати деякі екзогенні антигени.

3. По-третє, передбачено, що на кінцевому етапі розпізнавання вмикаються (за допомогою одного й того самого пептиду) різні механізми, які призводять в одному випадку до індукції імунної відповіді, а в іншому — до її супресії.

На практиці це підтверджено існуванням двох субпопуляцій Т-хелперів. Thl, продукуючи ІЛ-2, у-ІНФ, індукують клітинну відповідь, реалізовану специфічними Т-кілерами (С08+-клітинами). ТЬ2 індукують гуморальну відповідь за рахунок продукції ІЛ-4, ІЛ-5. Інтенсивність і клітинної, і гуморальної відповіді під контролем супресорного цитокіну — ІЛ-10, продукованого ТЬ2. За яким «сценарієм» буде розвиватися імунна відповідь, залежить від багатьох факторів, більшість із яких поки невідомі.

Ще раз підкреслимо, що інформацію про антиген, презентований молекулами HLA класу І, «зчитують» Т-лімфоцити-кілери (С08+-клітини), молекулами HLA класу II — Т-лімфоцити-хелпери (С04+-клітини).

Дуже важливо пам’ятати, що «зчитування» інформації про антиген Т-лімфоцитами (як CD8+, так і CD4+) можливе лише в тому разі, якщо її подано їм аутологічними HLA-молекулами. Ця закономірність лежить в основі правила імунного розпізнавання і сутності феномена HLA-рестрикції (тобто обмеження функції розпізнавання власними молекулами гістосумісності). За відкриття феномена HLA-рестрикції американським ученим Дохерті і Цинкернагель було присуджено Нобелівську премію.

ВЗАЄМОЗВ’ЯЗОК АНТИГЕНІВ СИСТЕМИ HLA ЗІ СХИЛЬНІСТЮ ДО ЗАХВОРЮВАНЬ

Вивчення зв’язків HLA-системи з деякими захворюваннями (табл. 6) має важливе значення для епідеміології, нозології, діагностики, прогнозу і лікування.

Історія дослідження зв’язку антигенів системи HLA із деякими захворюваннями включає два етапи. Перший — дослідження зв’язку між локусами А і В і хворобами. Зараз можна вважати доведеним, що антигени локусу В частіше пов’язані зі схильністю до захворювань. Другий етап включає вивчення зв’язків захворювань з антигенами DR-локусу. Зазначено, що при багатьох вивчених раніше хворобах зв’язок із локусом DR більш високий, ніж раніше виявлений для локусів А та В.

Для пояснення механізмів включення продуктів HLA-комплексу до патогенезу захворювань висунуто кілька гіпотез:

1. Рецепторна гіпотеза, згідно з якою певні антигени системи HLA є рецепторами для вірусів, що полегшують їх фіксацію і проникнення в клітину. Ця гіпотеза має багато аргументів за, однак є аргументи і проти. Наприклад, при такому захворюванні, явно вірусної етіології, як поліомієліт, а також при інфекційному мононуклеозі вірогідної кореляції з антигенами системи HLA не виявлено.

2. Гіпотеза молекулярної «мімікрії», яка полягає в тому, що деякі мікроорганізми несуть поверхневі специфічності, ідентичні HLA-структурам макроорганізму. Тому розвивається толерантність до даних мікроорганізмів, у зв’язку з чим розпізнавання не відбувається, а розвивається захворювання.

3. Гіпотеза про модифікацію (зміни) аутологічного, свого антигену (altered self), згідно з якою модифікований аутологічний антиген розпізнається імунною системою як чужорідний (non-self), що призводить до зриву толерантності.

4. Гіпотеза про вплив гіпотетичного Іг-гена на схильність до захворювань (порушення селекції антигенних детермінант, наявність «дірок» у репертуарі Т-лімфоцитів, порушення супресії, опосередкованої Т-лімфоцитами).

5. Гіпотеза про вплив «некласичних» HLA-генів, що картуються в межах ГКГ. Наприклад, гени HSP, ПНФ, недостатність С4а і С2 асоціюються з системним червоним вовчаком і піогенною інфекцією.

Не виключено, що хвороби, які асоціюються з підвищеною частотою якогось одного антигену HLA-системи, мають загальні етіологічні і патогенетичні механізми розвитку.

Таблиця 6. НІА-залежні хвороби (за Lechler, 1994; Yoo-Ниа Song і співавт., 1996; El-Aminl, 1996)

Захворювання

Антиген, на який розвивається імунна відповідь

HLA

Целіакія

а-Гліадин

DR3; DR7

Синдром Гудпасчера

Колаген базальної мембрани ниркових клубочків

DR2

Хвороба Грейвса

Тиреотропіновий рецептор

DR3; DR5

Зоб Гашімото

Тиреоглобулін

DR3; DR5

Інсулінозалежний цукровий діабет

Декарбоксилаза глутамінової кислоти (ДГК-65 та ДГК-67); інсуліновий рецептор; тирозин-фосфатаза IA-2-a та IA-2-p

DR3; DR4

Розсіяний склероз

Основний білок мієліну

DR3

Важка міастенія

Рецептор до ацетилхоліну

DR3

Хвороба Бехтерева

Невідомий

В27

Синдром Рейтера

Невідомий

В27

Перніціозна анемія (анемія Аддісона— Бірмера)

Н+/К+-АТФаза; внутрішній фактор

DR5

Нарколепсія

Невідомий

DR2; (DRwl5)

Системна склеродермія (прогресуючий системний склероз)

Д Н К-топоізомераза; РНК-полімераза

DR5

Псоріаз

Невідомий

DR7

Ревматоїдний артрит

Fc-фрагмент імуноглобулівнів; колаген; кальпастатин

DR7; DR21

Ювенільний ревматоїдний артрит

Fc-фрагмент імуноглобулівнів; колаген

DR5

Системний червоний вовчак

Двоспіральна ДНК

DR3; DR2

Вітиліго

Тирозиназа

DR4

Герпетиформний дерматит (хвороба Дюрінга)

Невідомий

DR3

Пухирчатка звичайна

“Pe-V-антигенний комплекс”

DR4; DRw6

136

Це підтверджують дані І. Bodmer (1980), який виявив зв’язок аутоімунних захворювань з алелями DR2-DR3-DR4. Це стосується і захворювань, які супроводжуються ураженням суглобів (хвороба Бехтерева, синдром Рейтера, ревматоїдний артрит), що також мають загальний генетичний маркер — антиген HLA-B27. На підставі даних літератури й наших досліджень можна припустити, що в осіб із певним HLA-фенотипом є схильність до того чи іншого захворювання або до групи захворювань. Не можна стверджувати, що HLA-система є єдиною, яка зумовлює підвищений ризик до розвитку захворювань. Не виключено, що подальші дослідження сприятимуть відкриттю інших систем і факторів ризику.

ВИЗНАЧЕННЯ HLA-ФЕНОТИПУ

На мембрані клітин організму присутні продукти генів усіх локусів, розміщених на обох нитках 6-ї хромосоми. Це означає, що HLA-гени успадковуються за кодомінантним типом, тобто одну хромосому дитина успадковує від матері, а другу — від батька. Як уже згадувалося, сукупність генів, розташованих на одній хромосомі, утворює гаплотип. Таким чином, у людини два гаплотипи і кожна клітина організму несе на собі диплоїдний набір антигенів системи HLA, один із яких кодується HLA-генами матері, а інший — батька. Винятком є статеві клітини (яйцеклітина і сперматозоїд), кожна з яких містить у своєму ядрі тільки по одному гаплотипу.

Антигени гістосумісності, виявлені на клітинах конкретної людини, формують HLA-фенотип. Для його визначення необхідно здійснити фенотипування клітин індивіда. Як правило, «типуються» лімфоцити периферійної крові. У даному разі не відомо, які саме HLA-антигени яким із двох гаплотипів батьків кодуються. Щоб це визначити, необхідно зробити типування батьків, після чого можна встановити гаплотипи обстежуваної людини і відповідно її генотип — послідовність розташування генів на хромосомі. На практиці HLA-фенотип записують, дотримуючи числового порядку HLA-антигенів, відповідно до номенклатури. Наприклад: HLA-фенотип суб’єкта—А1, 2; В5, 12; DR2, 5; DQ3, 4.

У даному разі можна припустити 100 варіантів гаплотипів батьків, 50 із яких належать матері, а 50 — батькові. Визначити їх, як уже зазначалося, можна лише шляхом типування.

Якщо в результаті типування визначають тільки один антиген за якимось локусом, то це є наслідком гомозиготності індивіда за даним геном. Отже, від батька і матері успадковано алель однакової специфічності.

Дотепер у більшості лабораторій HLA-A, -В, -С й -DR-антигени визначають за допомогою серологічних методів, зокрема лімфоцито-токсичного тесту. Цей тест засновано на здатності анти-Н LA-антитіл у присутності комплементу руйнувати лімфоцити, які несуть відповідні антигенні детермінанти. Загибель клітин демонструється за допомогою додавання трипанового синього. При цьому мертві ушкоджені клітини фарбуються і під мікроскопом рахують їх кількість. Застосовують також мікрометод, який є модифікацією лімфоцитотоксичного тесту. Для його постановки використовують 1 мкл типованих сироваток, а також невелику кількість клітин. Мікролімфоцитотоксичний тест є стандартним, його використовують у всіх типувальних лабораторіях світу. Набір типованих сироваток (типувальна панель) створюють у результаті кропітких досліджень із зразків сироваток, що містять анти-Н LA-антитіла. Ці антитіла можуть індукуватися в період вагітності, при гемотрансфузіях, а також у результаті пересаджування алотрансплантатів. Основними продуцентами типувальних сироваток є жінки, які багато народжували і яких імунізують HLA- продуктами чоловіка під час виношування.

Уявлення про будову системи HLA розвивались і розвиваються протягом усього періоду її вивчення, однак за останні роки відбувся якісний стрибок у вирішенні цієї проблеми. Раніше, коли основним об’єктом дослідження були тільки антигени системи HLA, уявлення про комплекс генів HLA могли формуватися в основному на аналізі непрямих даних, що включають вивчення антигенів системи HLA в популяціях, сімейному аналізі, реакціях, субстратом яких були HLA-антигени. Тепер, завдяки розвитку молекулярної генетики й імунохімії, з’явилася можливість не лише проводити тонкий аналіз HLA-антигенів, а й вивчати самі гени HLA. Особливий прогрес у цьому напрямку було досягнуто після відкриття і впровадження в дослідження в галузі вивчення системи HLA методу полімеразної ланцюгової реакції (ПЛ Р), який дає змогу аналізувати необхідні для досліджень ділянки ДНК, що у свою чергу відкрило широкі можливості для швидкого і точного аналізу молекулярного поліморфізму HLA.

Реакцію ампліфікації ДНК in vitro засновано на здатності молекул нуклеотидтрифосфатів у присутності ДНК-полімерази за відповідних умов (pH, іонна сила розчину, температура) утворювати на матриці (одноланцюговій ДНК) комплементарний ланцюг. Необхідною умовою синтезу є наявність праймеру — олігонуклеотиду, синтезованого штучно.

Для підвищення точності реакції і чутливості, як правило, використовують пари праймерів. Керують ходом реакції за допомогою зміни

138

температурних умов. За певної температури (залежить від нуклеотид-ного складу ДНК) відбувається розбіжність подвійного ланцюга ДНК — плавлення. Зниження температури призводить до зворотного процесу — з’єднання комплементарних ланцюгів — віджигу. За надлишку праймерів у розчині ймовірність віджигу на ДНК-матриці праймеру набагато вища, ніж приєднання повного ланцюга. І оскільки праймер менший від матриці, починається активне добудовування (синтез) комплементарного ланцюга. Швидкість добудовування досягає кількох сотень (іноді понад тисячу) нуклеотидів у секунду. Таким чином, наприкінці циклу є подвоєний набір ДНК (точніше, не всієї ДНК, а ділянки, обмеженої праймерами). Знову підвищується температура — плавлення — віджиг — синтез — і в розчині вже 4 копії вихідної матриці. Кількість копій (ампліфікатів) збільшується в геометричній прогресії, і після 30—40 циклів у розчині міститься від 10 млн до 10 млрд копій вихідної матриці. Причому оскільки є пари праймерів, ампліфікати будуть суворо певного розміру. Таку кількість ДНК можна візуально виявити, наприклад шляхом електрофорезу на агарозному гелі з етидію бромідом.

Існує декілька методик проведення полімеразної ланцюгової реакції.

SSO (sequence specific oligonucleotide) — неспецифічна ампліфікація досліджуваної ділянки (локусу) ДНК із наступною специфічною гібридизацією з міченими ДНК-зондами.

RFLP (restriction fragment length polymorphism) — неспецифічна ампліфікація з наступним перетравлюванням продуктів ампліфікації набором рестриктаз. За довжиною отриманих продуктів судять про нуклеотидний склад.

SSCP (single-strand conformation polymorphism) — різниця алелів за електрофоретичною рухомістю одноланцюгових фрагментів ДНК, зумовленою характерними елементами вторинної структури.

SSP (sequence specific primer) — найбільш поширена і технічно проста методика, коли кожному алельному варіанту або групі алелів відповідає своя пара праймерів. Розроблено нову модифікацію цієї методики — MSSP (mixture of sequence specific primer), яка дозволяє за рахунок більш раціонального вибору праймерів і режимів ампліфікації виявити відразу декілька специфічностей, використовуючи одну пробірку й одну доріжку на гелі. Тривалість визначення — приблизно

2,5—3 год.

Як було сказано вище, для виявлення класичних антигенів системи HLA локусів А, В, С та DR використовують серологічну реакцію мікролімфоцитотоксичності, у якій застосовують спеціальні антисироватки, що містять антитіла до зазначених антигенів.

Молекулярне ж типування дозволяє за допомогою методу ПЛР виявляти різні алелі HLA на рівні ДНК. Це дає можливість визначати ті алелі генів HLA класу II, які або важко виявити за допомогою серологічного типування, або неможливо. Так, наприклад, за допомогою серологічної техніки в локусі DR виявлено 14 антигенів, а за допомогою ДНК-типування — понад 100 алелів.

Встановлення нових, реально функціонуючих алелів змусило переглянути номенклатуру «HLA», яка існувала раніше, і на сьогодні прийнято чотирицифрове позначення (наприклад А0101 замість А1). У тих випадках, коли встановлено декілька алелів, які, за колишніми уявленнями, кодували різні субтипи одного антигену (наприклад, у HLA-A2 було встановлено 12 таких субтипів), тепер їх позначають як різні алелі, що мають загальні перші цифри. Наприклад, від HLA0201 до HLA0212 або від HLAB2701 до HLAB2707.

Сказане вище прямо стосується тільки класу I HLA, де поліморфною є лише один ланцюг. У класі II через можливий поліморфізм як |3-, так і а-генів установлені алелі позначають залежно від ланцюга, який несе варіабельні ділянки ДНК, що визначає специфічності, наприклад DQA1-0501 і DQB1-0501.

На сьогодні селекція донора і реципієнта за HLA-антигенами із використанням ДНК-типування стала рутинним методом у гипувальних лабораторіях, трансплантаційних центрах. Дані останніх років свідчать, що виживаність трупного ниркового алотрансплантату протягом 1 року в разі добору пари донор—реципієнт шляхом ДНК-типування становить 90%. У той самий час у разі добору пари за допомогою серологічного типування ця сама цифра становила приблизно 68%.

Не менш важливим є визначення HLA-фенотипу методом ДНК-гипування під час вирішення питання про спірне батьківство. У цьому досить відповідальному і делікатному питанні використання І1ЛР також підвищує точність аналізу.

Нарешті, значну роль відіграє практичне застосування ПЛР для ідентифікації ДНК мікроорганізмів під час проведення діагностики інфекційної патології. Накопичений досвід відкриває величезні перспективи використання ПЛР у цій галузі.

Клінічна імунологія та алергологія: Підручник Г.М. Драннік