8.4. Диагностика НР-инфекции.

8.4.1. Микробиологическая диагностика.

Предметом исследования для микробиологической диагностики HP является био-птат из слизистой оболочки желудка или двенадцатиперстной кишки. Поскольку биоптат берется в эндоскопическом отделении, а исследование его должно проводиться в микробиологической лаборатории, то существует проблема транспортных сред, то есть таких жидких сред, при помещении в которые бактерия в биопта-те сохраняет свою жизнеспособность в течение определенного времени, достаточного для переноса исследуемого материала в лабораторию, его обработки и посевана дифференциально-диагностическую среду. Данную проблему осложняет то обстоятельство, что HP является микроаэрофилом, то есть концентрация кислородав атмосферном воздухе слишком высока для нее и он губительно действует набактерию.

Транспортные среды существуют нескольких видов. На ранних этапах изучения HP часто использовали физиологический раствор, но его применение возможнотолько в том случае, если биоптат находится в такой среде не более 30 минут (4),в дальнейшем при комнатной температуре HP очень быстро теряет жизнеспособность (5) и это может сказаться на результатах микробиологического исследования. Позднее было установлено, что сохранение слоя слизи на биоптате слизистойоболочки существенно важно для получения хороших результатов микробиологического исследования, поэтому транспортные среды должны быть как можноменьше по объему. Одной из наилучших транспортных сред является 0,5 мл 20%раствора глюкозы. При температуре 4°С биоптат можно сохранять в ней в течение 5 часов без какой-либо потери жизнеспособности бактерией (6). Другие исследователи использовали в качестве транспортных сред питательные бульоны, тио-гликолевую среду, транспортную среду Стюарта (7) и др. Были предприняты попытки создать сложные транспортные среды для HP, содержащие в качестве компонентов сыворотку лошадиной крови с витаминными добавками, а также наборантибиотиков, к которым HP устойчива, тем не менее статистически достоверного превосходства над простыми транспортными средами в сравнительном исследовании они не получили (8).

Важной является проблема длительного хранения уже полученной чистой культуры HP, это необходимо для сохранения отдельных штаммов, распространения «стандартных»; штаммов, необходимых для оптимизации иммунологических исследований, связанных с этой инфекцией, прочих нужд фундаментальной науки.К сожалению, при хранении в сухом замороженном виде HP не дает роста впоследствии, и поэтому, для ее длительного хранения следует применять другие методы (9). Установлено, что бактерия хорошо сохраняется при температуре -70°Сили в жидком азоте, причем не без успеха используются различные среды. Например, 1% пептонная вода, содержащая 15% глицерина (10), (другие исследователипредпочитают концентрацию глицерина увеличивать до 25% (11)), бульон длябруцелл (12), триптиказа соевый бульон, содержащий 15% глицерина (13) и другие позволяли сохранять жизнеспособность бактерии на протяжении месяцев. Нолучшей средой для сохранения HP является дефибринированная лошадинаякровь, в которой бактерия способна сохранять жизнеспособность, несмотря нанесколько размораживаний. Ряд исследователей используют кровь кроликов илиовец (14,15). В одном из исследований HP замороженная в дефибринированнойлошадиной крови, содержащей 10% глицерина, при -70°С сохраняла жизнеспособность в течение 2 лет и более (11).

Селективные среды для выращивания HP существуют в различных прописях, подавляющее большинство исследователей используют плотные среды, в которые обычно входят: основа кровяного агара №2 (Oxoid) (10,16), основа агара Колумбия (10), агар для выделения бруцелл (17). Обычно к одной из основ добавляют 5-10% крови овец или лошади. Одни исследователи сообщили, что добавлениецельной крови дает лучшие результаты, чем добавление лизированной крови (6),другие, напротив, сообшают о превосходстве сред, содержащих лизированнуюкровь (18). Многие исследователи продолжают использовать среду Скирроу, которая применяется для выделения термофильных кампилобактеров из кала(18,19). В эту среду так же входит лизированная кровь, а кроме того набор антибиотиков: ванкомицин в концентрации 10 мг/л, полимиксин В — 2500 МЕ/л, три-метоприм 5 мг/л. Ряд исследователей считают, что бактерия хорошо выделяетсяпри посеве на «шоколадный»; агар (20,21,22), который может быть приготовленнагреванием кровяного агара или из основы агара GC с добавлением дрожжевогоэкстракта, гемоглобина или гемина, а так же различных других добавок. Успешноиспользуются среды на основе триптиказа соевого агара (21), агара Мюллера-Хинтона (21), Уилкинс-Шальгрена (22) и других.

Добавление к прозрачным плотным средам трифенил тетразолиум хлорида (ТТС), например, к таким как сердечно-мозговой агар, содержащий 10% лошадиной сыворотки и 0.25% дрожжевого экстракта, хорошо выявляют рост колоний,поскольку растущие бактерии HP редуцируют ТТС и дают колонии, окрашенные

в красный цвет (6). На других средах HP дает рост мелких до 1-1,5 мм в диаметре колоний золотисто-желтого цвета.

Несмотря на то, что среды, содержащие кровь или ее компоненты хорошо зарекомендовали себя при выделении HP, продолжается разработка сред с другими питательными добавками. Идет интенсивный поиск таких добавок, которые давали бы более быстрый рост бактерий и лучшую переносимость бактериейкислорода. В частности, пытались применить так называемую добавку FBP, содержащую по 0,25% сульфата железа, метабисульфита натрия и пирувата натрия, которая нейтрализует губительное действие кислорода на жизнедеятельность и рост Campylobacter jejuni (23). К сожалению, метабисульфит натрия подавляет рост некоторых штаммов HP (6), поэтому, коммерчески производимые добавки FBP использовать не стоит, что, однако не исключает использования ее отдельных компонентов. Используют широко смеси ,,Vitox“ (Oxoid) и ,,Is-ovitalex»; (BBL), идентичные по составу, содержащие различные факторы ростабактерий (6), хотя ценность каждого в отдельности фактора роста для HP не изучалась. В одном исследовании ,,Vitox“ вообще не дал ощутимых результатов вотношение роста бактерий, правда в данном случае использовалась жидкая среда(15).

Недавно была предложена новая, не содержащая крови и ее компонентов среда, на основе эмульсии яичного желтка. Среда содержит основу агара Колумбия,

10% эмульсии яичного желтка (Oxoid), 1% ,,Isovitalex“ (BBL) и ТТС в концентрации 40 мг/л (Sigma). Среда предложена как для выделения, так и для культивирования бактерии; при сравнении с тремя наиболее известными средами, содержащими компоненты крови, она давала наиболее быстрый и качественный рост колоний, размер которых к 7 дню достигал 3 мм (24). к

Следует добавить, что, используя среды, содержащие кровь и ее компоненты, недопустимо пользоваться человеческой кровью, поскольку в ней могут содержаться антитела к HP и это существенно изменит результаты исследования.

Рассев материала производится следующим образом: транспортная среда выливается вместе с биоптатом на агар, биоптат накалывается на иглу или захватывается глазным пинцетом, затем делают серию мажущих движений биоптатом по агару, стараясь захватить при этом как можно больше пространства. Затем чашка Петри помещается в микроанаэростат, в оптимальные температурные условия на 3-7 дней. Не следует пользоваться гомогенизаторами для измельчения биоптата, поскольку основная масса бактерий находится в слое слизи на поверхности эпителия, а не в самой ткани, кроме того, гомогенизация биоптатав условиях доступа воздуха приводит к потере жизнеспособности бактерии и ис-г

кажает результаты микробиологического исследования.

Определенное значение имеет pH среды, хотя микроб растет в достаточно ши- |

роких пределах pH от 5,5 до 8,5, тем не менее наилучшие условия роста наблюдаются при pH 6,9-8,0 (15,19,25).

HP растет в микроаэрофильной атмосфере, состоящей из 5% О, 5-10% СО, остальное — N (6), и не может расти в анаэробных условиях. Такую атмосферулегко создать в микроанаэростате с использованием газорегенераторных пакетов(,,гас-пацк“), которые начинают продуцировать газовые смеси при добавлении вних воды. Можно использовать газорегенераторные пакеты, предназначенныедля анаэробов, удалив предварительно из крышки микроанаэростата катализатор, тогда в нем образуются микроаэрофильные условия (21). У нас в стране подобные пакеты под названием «Кампилогаз»; производятся МНПО «Синтез»;.

Газорегенераторные пакеты удобны также и тем, что используемая в них вода создает в микроанаэростате необходимую для роста HP влажность (около 98%)(6,20). В том случае, когда не используются газорегенераторные пакеты, а микро-анаэростат заполняется газовой смесью извне, необходимо положить в негофильтровальную бумагу, смоченную водой.

Оптимальный температурный режим для роста бактерии 37°С, хотя имеются сведения, что отдельные штаммы могут расти и при более высокой температуре(17,21,22). Время инкубации в термостате большинство исследователей определяют сроком 3-7 дней. Такой рзброс обусловлен и различными средами,которые использовались для выделения бактерии, а также, очевидно, разными методическими подходами и свойствами штаммов.

При получении роста характерных колоний, которые мы описывали выше, производят окрашивание мазка по Граму для микроскопии. HP выглядят в виде гра-мотрицательных изогнутых, S-образных или V-образных палочек. Иногда их форму образно описывают как «крылья летящей чайки»;. На одном конце бактерии находятся жгутики.

Затем определяют биохимические свойства бактерии. Для HP характерны: уре-азная, каталазная, оксидазная активность, образование сероводорода. Бактерия не редуцирует нитраты, не образует индол, не ферментирует глюкозу. Продукцияв большом количестве уреазы является наиболее характерным признаком HP. Вчастности появлявшиеся в одно время сообщения о существовании HP с отсутствием уреазной активности (20) были связаны, как было показано позднее, с методическими ошибками (11). В настоящее время получены штаммы бактерии сотсутствием такой активности с помощью генной инженерии, но они оказалисьнепатогенны для человека (26).

Как видно из представленного выше, микробиологический способ диагностики HP-инфекции включает в себя несколько стадий, необходимых для идентификации микроорганизма, а кроме того, данный метод применяется для определениячувствительности HP к различным антибактериальным средствам. Хотя ряд ис

следователей и называют микробиологический метод «золотым стандартом»;, он имеет ряд существенных недостатков и неудобств, связанных как с самим методом, так и с особенностью течения и диагностики заболеваний, ассоциированныхс HP.

Прежде всего, при первичном обследовании больного микробиологическое исследование биоптата целесообразно не столько в смысле обнаружения бактерии, сколько для определения чувствительности штамма HP у данного больного к антибактериальным средствам, прежде всего к производным нитроимидазола ипрепаратам группы офлоксацина, к которым у HP нередко выявляется резистентность (см. Главу 9). Нет нужды исследовать чувствительность штаммов к производным пенициллинового или тетрациклинового ряда, до настоящего времениустойчивых штаммов не обнаружено. После лечения антибактериальными средствами применять микробиологический метод для оценки эффективности леченияне стоит, поскольку наличие или отсутствие бактерии можно обнаружить болеедешевыми и не менее достоверными методами. В процессе наблюдения за больными необходимо довольно часто оценивать обсемененность слизистой оболочкижелудка HP. В таких случаях все зависит от целей и задач конкретного исследования. Если необходимо знать только есть бактерия или нет, то лучше использоватьнеинвазивные методы, то есть радионуклидные и серологические. Если исследование требует серий эндоскопического контроля и определения HP (например, приязвенной болезни или эрозивных процессах на фоне пролонгированного лечения)лучше использовать биохимические методы обнаружения бактерии. Если исследование связано с динамическим наблюдением и оценкой лечения хронического гастрита, то, предпочтение, конечно, нужно отдать морфологическому методу. Влюбом из этих случаев микробиологический метод будет дополнительным, еслине сказать точнее — лишним. В каждом конкретном случае нужно выбирать наиболее быстрый и дешевый способ определения HP.

8.4.2. Морфологические методы выявления HPв биопсийном материале.

Морфологические методы выявления HP в биоптатах слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки достаточно надежны и при сравнении информативности различных методик их определяют даже как «золотой стандарт»; (27).

Обнаружить HP можно и на обычных, окрашенных гематоксилином и эозином препаратах. Удается это правда, только на достаточно тонких и хорошо окрашенных срезах.

Для элективной окраски HP применяют различные методики. В последнее время появились сообщения об использовании в этих целях иммуноцитохимии и гибридизации in situ. Специфичность и высокая чувствительность этих двух по

следних методик очевидна, но и все тинкториальные методики, применяемые для выявления HP достаточно специфичны. Наиболее чувствительными оказалисьокраски акридиновым оранжевым (85%) и красителем Гимзы (79%). Несколькоменьше чувствительность окраски по Граму (72%) и серебрения по Вартин-Старри (67%) (28).

Окраска акридиновым оранжевым (29).

Приготовление красителя: акридиновый оранжевый — 20 мг растворить в 190 мг буфера (110 мл 1 н ацетата натрия и 90 мл 1 н HCL). Раствор хранить в темномфлаконе в холодильнике.

Окраска. Депарафинированные срезы поместить в воду, окрасить в растворе акридинового оранжевого 2 мин, промыть в воде, высушить на воздухе, просветлить в ксилоле (минуя спирты), заключить в бальзам.

Результаты. При ультрафиолетовом освещении бактерии легко различимы по оранжевой флюоресценции, флюоресценция желудочного эпителия зеленая в апикальной части и оранжево-желтая у основания, эритроцитов — зеленая, лейкоцитов — оранжевая.

Особенно эффективна эта методика при выявлении малого количества HP, здесь она превосходит методики и Вартина-Старри и Гимзы.

Метод Вартина-Старри.

Фиксация биоптатов в 10% растворе формалина, заливка в парафин. Приготовление растворов:

1. Подкисленная вода: тридистиллированная вода — 1000 мл, лимонная кислота

— 10,0.

2. Раствор нитрата серебра:

нитрат серебра — 2,0, подкисленная вода — 100 мл. Для приготовления 1% раствора добавить равный объем подкисленной воды.

3. Раствор гидрохинона:

гидрохинон — 0,15, подкисленная вода — 100 мл.

4. Раствор желатины:

особо чистая желатина — 10,0, подкисленная вода — 200 мл.

5. Проявитель:

2% раствор нитрата серебра — 1,5 мл, 5% раствор желатины 3,75 мл, 0,15% раствор гидрохинона — 2,0 мл. Растворы подогреть до 50-60°С, смешать вуказанном порядке. Использовать немедленно.

Окраска:

1. Депарафинированные срезы довести до подкисленной воды.

2. 1% раствор нитрата серебра при 55-60°С — 30 мин.

3. Проявитель 3-5 мин. (срезы становятся светло коричневыми).

4. Промыть в теплой воде (55-60°С), затем в дистилированной воде.

5. Обезвоживание, просветление, заключение в канадский бальзам.Результаты. HP — черные, хорошо видна их изогнутая форма. Фон — от желтого до светло-коричневого.

Следует отметить, что эта методика капризна и удается далеко не всегда. Для ускорения окраски HP и уменьшения расхода реактивов предложена модификация метода Вартин-Старри (30).

Депарафинированные срезы помещают в раствор, содержащий 20 мл 5 г/л AgN03 в ацтатном буфере pH 4 и облучают 1 мин микроволновым процессором.Срезы без промывания переносят в свежеприготовленный проявитель (10 мл 20г/л AgN03 + 50 г/л желатины + 14 мл 1,5 г/л гидрохинона в ацетатном буфереpH 4 при 60°Q, промывают в ацетатном буфере (60°С) и в дистиллированной воде, фиксируют в 30 г/л тиосульфата натрия, промывают, обезвоживают и заключают. HP окрашиваются в черный цвет.

Наиболее простым и доступным методом выявления HP в биоптатах является окраска их по методу Гимзы без дифференцировки. Эта методика пригодна какдля гистологических, так и цитологических препаратов.

Метод Гимзы

Приготовление растворов:

1. Основной раствор: краска Гимзы — 1,0, глицерин — 54 мл, спирт 96° — 84 мл(профильтровать).

2. Рабочий раствор: основной раствор — 1,0 мл, дистиллированная вода — 38мл, 0,1% раствор углекислого калия — 2,0 мл.

Окраска.

1. Депарафинированные срезы поместить в дистиллированную воду 10-15 мин.

2. Рабочий раствор — 20 мин.

3. Промывание в дистиллированной воде.

4. Обезвоживание, просветление, заключение в канадский бальзам.

Результаты. HP окрашиваются в темно синий цвет, они хорошо видны как на

поверхности эпителия, так и в глубине ямок.

При использовании 20% раствора Г имзы время окраски сокращается до 5 мин (31). Преимущество методики не столько в сокращении времени, сколько в том,что при этом почти не окрашивается сама слизистая оболочка и муцин. Благодаряэтому достигается высокая элективность окраски.

При необходимости для экспресс-диагностики HP с успехом может использоваться биоптат слизистой оболочки, из которого готовят мазок путем раздавли-

нация с последующей его фиксацией в 96° спирте в течение 15 мин и окраской по Г имзе.

Окраска карболовым фуксином (32)

Приготовление реактива-.

Основной фуксин — 0,4 Фенол кристаллический — 2,0Абсолютный спирт — 4 млдистиллированная вода — 100 млОкраска.

1. Депарафинированные и доведенные до воды срезы поместить в краситель на5 мин.

2. Промыть в проточной воде.

3. Промыть в ацетоне.

Срезы можно не заключать, исследовать под иммерсионным маслом. Результаты. HP — темно-красные.

Высокоэлективной окраски HP можно достичь при использовании толуидино-вого синего О в веронал-ацетатном или в фосфатном буфере (33).

Окраска толуидиновым синим

Приготовление реактивов.

1. Ацетат натрия — 1,943 г Барбитурат натрия — 2,943 гДистиллированная вода — до 100 мл

К 10 мл основного раствора добавить 22 мл М/10 HCL, 18 мл дистиллированной воды и 1 мл 1% толуидинового синего О.

А. Двуосновной ацетат натрия (Na2HC03) — 9,465 г Дистиллированная вода до 1 лБ. Кислый фосфат калия (КН2РО4) — 9,08 гДистиллированная вода до 1 л

К 25 мл раствора А добавить 25 мл раствора Б и 1 мл 1% толуидинового синего.

Продолжительность окраски 10-15 мин.

Результаты. HP и ядра клеток, в том числе и полиморфно-ядерных лейкоцитов — темно-синие. Фон окрашен слабо, что облегчает выявление HP.

Наиболее чувствительным методом идентификации HP является иммуноцито-химический метод с моноклональными антителами и комплексом авидин биотин

пероксидаза. Еще недавно применение его затрудняла необходимость использования замороженных срезов. В настоящее время существуют коммерческие наборы, позволяющие исследовать обычный биопсийный материал фиксированный в формалине и залитый в парафин. Моноклональные антитела, входящие в эти наборы,работают при разведении 1:200000 и избирательно окрашивают только HP (34).

Весьма обнадеживающие результаты получены при выявлении HP методом гибридизации ДНК в обычных парафиновых срезах (35). Методика не только чувствительна, но и высоко специфична. С ее помощью можно идентифицировать различные штаммы HP. Это имеет большое значение для понимания природы рецидивов обсеменения после успешного лечения. Представляется возможностьустановить идет ли речь о реинфекции или о размножении сохранившихся HP.

При изучении HP в гистологических или цитологических препаратах можно выделить 3 степени обсеменения слизистой оболочки (36). 1) слабая степень ( + ) — до 20 микробных тел в поле зрения при хбЗО; 2) средняя степень ( + + ) — до 50микробных тел в поле зрения; 3) высокая степень (+ + +) — более 50 микробныхтел в поле зрения.

Хронический гастрит, Л.И. Аруин, 1993