8.4.5. Иммунологические методы диагностики HP.

Иммунологическая диагностика HP основывается на том факте, что у всех больных, инфицированных HP, в слизистой оболочке желудка продуцируются антитела (59) к антигенам, покрывающим клеточную стенку и жгутики бактерии (60). В подавляющем большинстве случаев эти антитела можно обнаружить в сывороткекрови различными методами. Сравнительную их оценку мы представляем в Таблице 8.3.

Таблица 8.3. Харктеристики различных методов обнаружения антител к HP.

Метод

Простота

Специфичность

Чувствительность

Стоимость

Гемагглютинации

простой

средняя

средняя

небольшая

Реакция связывания комплемента

простой

средняя

средняя

небольшая

Иммунолюоресценция

средней

сложности

средняя

средняя

средняя

Western blotting

простой

высокая

высокая

высокая

средней

сложности

средняя

средняя

средняя

Как видно из приведенных в ней данных, а также учитывая, что метод иммуно-ферментного анализа (ИФА) наиболее интенсивно использовался в последнее время и накоплен значительный опыт, следует признать, что сегодня он является наиболее предпочтительным из методов иммунологической диагностики (61). Поэтому в данном разделе мы подробно остановимся на нем.

Для определения антител к антигенам HP используют непрямой неконкурентный ИФА, который состоит из нескольких стадий. Сначала связывают имеющийся антиген с твердой фазой (полистироловой пробиркой, специальной плашкой для ИФА и др.), затем отмывают избыток антигена и инкубируют с пробой, содержащей антитела (в данном случае сыворотка крови больного), избыток антител снова отмывают. Затем добавляют анти человеческие антитела, обычно IgG,меченные каким-либо ферментом, чаще всего пероксидазой, избыток их отмывают, а затем добавляют в пробирку или плашку субстрат для ферментативной реакции, продукты которой обладают способностью менять оптическую плотностьсреды, то есть окрашивать ее, и она прямо пропорциональна количеству связанных антител. В целом исследование занимает около 2 часов, но в современных аппаратах для ИФА некоторые стадии автоматизированы, поэтому реально затрачиваемое время значительно меньше, а кроме того, они дают возможность исследовать сотни проб в течение рабочего дня.

Чувствительность и специфичность ИФА зависит в очень большой степени от характеристик антигена, к которому определяются антитела (61). Оптимально

антиген должен содержать иммуногенные детерминанты, которые были бы свойственны всем штаммам бактерии, должен легко приготовляться и подвергаться очистке, легко связываться с пластиковой стенкой пробирки или плашки,а также не терять эти свойства при длительном хранении. Таким критериямобычно удовлетворяют белковые антигены или гликопротеиды. Обычно дляИФА при определении антител к HP используют комплекс антигенов, такой как,например, целую бактерию, разрушенную центрифугированием (62) или антигены экстрагированные с поверхности бактериальной стенки (63). В настоящее время усилия исследователей сосредоточены в основном на очистке и выделении антигена приемлимого для исследования. Однако, в принципе, чем лучше очищенантиген, тем ниже чувствительность исследования (64). Это связано с вариабельностью иммунного ответа у больных, и поэтому невозможно выделить единственный антиген HP, к которому бы у каждого больного продуцировались антитела.

Серьезной проблемой в использовании антигенов, наиболее простых и дешевых в получении, таких как разрушенная центрифугированием целая бактерия является потеря специфичности. Это связано с тем, что ряд бактерий имеет довольноблизкие по структуре антигены бактериальной стенки и антитела в крови больного против других бактерий могут реагировать с антигенами, полученными из HP.Существуют две группы антигенов HP в отношение которых известно, что ониимеются у других микроорганизмов. Так, антитела к некоторым жгутиковым антигенам Campylobacter jejuni и Campylobacter coli также связываются с HP (65).Данные возбудители довольно часто являются причиной острых энтеритов, азначит сыворотка крови больных, перенесших кампилобактериоз или просто проживающих в регионе, где носительство этих возбудителей встречается часто, может содержать неспецифичные антитела. Второй группой антигенов являются антигены уреазы. Известно, что антигенная структура уреазы HP идентична таковой у Gastrospirillum hominis (66), которая также может выявляться у человека(см.предыдущие главы).

В целом, ИФА с использованием комплекса антигенов сегодня выявляет антитела у 85-95% больных у которых HP обнаружена микробиологически и/или гистологически (67). Специфичность такого исследования обычно выше 95%. Ряд авторов утверждают, что использованные ими частично очищенные комплексыантигенов дают 100% специфичность и чувствительность (68), но они еще не прошли независимой оценки в других лабораториях. В целом же, увеличение специфичности за счет использования более очищенного антигена обычно сопровождается снижением чувствительности метода. Работы проведенные в последнее время позволяют предполагать, что экстрагированный и обработанный HCL антиген, является сегодня наилучшим (64).

В различных исследованиях около 5% сывороток дают ложноположительный результат. Это можно объяснить различным образом. Вполне возможно, что»эталонный»; метод не смог выявить HP, например при гастроскопии был взятбиоптат в котором не было HP, и результаты гистологического или микробиологического метода закономерно были отрицательны. Возможно больной вообщене инфицирован HP, но у него в крови имеются антитела к другим бактериям, которые перекрестно реагируют с антигеном HP. Существует и третье, наименее вероятное объяснение: у больного HP исчезла естественным путем, а антитела вкрови сохранились, поскольку они элиминируются очень медленно. Однако, сегодня нет веских доказательств самопроизвольного исчезновения HP из слизистой оболочки желудка.

Примерно у такого же числа больных (5%) имеются ложноотрицательные результаты в ИФА при использовании комплекса антигенов. У некоторых больных удавалось серологически все же диагностировать инфекцию, применив более очищенный антиген HP. Возможно, что в эти 5% попадают и больные с острой фазой HP инфекции, когда специфические IgG в сыворотке крови с помощью ИФАеще не определяются.

Большим приемуществом ИФА является возможность определять различные классы и подклассы антител. В настоящее время подавляющее большинство исследователей определяют в сыворотке крови больных специфичный к HP IgG.Это связано с тем, что в слизистой оболочке желудка антитела представлены преимущественно IgG, а в крови — IgG, обычно подклассами, и.

Недавно проведенные исследования показывают, что одновременное определение в крови IgA и IgG не приводит к дополнительному увеличению чувствительности метода, но, повышение в крови специфичного IgA обычно отражает степень повреждения слизистой оболочки (69).

Только в нескольких случаях удавалось обнаружить появление специфичных к HP антител класса IgM: на ранних стадиях инфекции в опытах с самозаряжением(69) и в ряде острых инфекций у детей (личное сообщение D. Newell). Но это появление кратковременно и его очень трудно зарегистрировать.

Иммунологические методы диагностики HP, особенно ИФА могут использоваться со следующими задачами: для проведения эпидемиологических исследовании, при длительном (на протяжение лет) наблюдении за больными после успешного лечения, скриннинга больных с диспепсическими симптомами.

Определение в сыворотке крови специфичных к HP антител является методом выбора для изучения распространения данной инфекции в популяции. Возможность обследовать большое количество проб при отсутствии больных, например,в банках крови, станциях переливания крови, а также в учереждениях, располагающих большими запасами замороженной плазмы позволяет оценить распростра

ненность инфекции не только в возрастных группах, но и получить интересные данные с помощью ретроспективного анализа. Сравнительный анализ данных,полученных в разных странах и у лиц различной национальности, может выявитьгеографические и расовые особенности распространенности НР-инфекции. Сопоставление данных о распространенности HP в определенной возрастной группе,и длительное ее наблюдение, с одновременным скриннингом по возникновениюрака желудка, очевидно, позволит более определенно судить о связи НР-инфекциии этого заболевания.

В связи с тем, что нередко при лечении НР-инфекции не всегда удается ее подавить и достаточно часто наступает реинфекция, то при наблюдении за больными довольно часто требуется вновь определять наличие бактерии в слизистой оболочке желудка после проведенного лечения. Безусловно, для определения HP непосредственно после лечения или в короткие сроки после его завершения удобнопользоваться неинвазивными радионуклидными методами, поскольку они определяют бактерию как таковую. Но эти методы не применимы при незначительной обсемененности или после оперативных вмешательств на желудке (70). Вэтих случаях, да и в других можно использовать ИФА, снижение в крови антителможно зарегистрировать спустя месяц после удачного лечения, а дальнейшее ихснижение к третьему месяцу является надежным признаком успешной терапии.Спустя два года после уничтожения HP специфический IgG определяется в концентрации близкой 20 мкг/мл.

Новой областью применения иммунологических методов диагностики HP является скриннинг больных с диспепсией. До открытия HP было очевидно, что все больные с диспепсической симптоматикой должны обследоваться с помощьюэндоскопии. Но такой подход реально неосуществим из-за большого количестватаких больных и высокой стоимости исследования. Поэтому определение HP методом ИФА или другим более дешевым и простым иммунологическим методомможет: 1) выявить серонегативных больных и в отношении их можно будетопределить целесообразность дальнейшего обследования; 2) выявить серопозитивных больных, которым можно назначить соответствующее лечение без эндоскопии.

Большинство серонегативных больных при обследовании их с помощью эндоскопии здоровы. У значительной части из них гистологическая картина слизистой оболочки желудка нормальна (71). Из этой группы следует проводить эндоскопическое обследование лицам получающим нестероидные противовоспалительные препараты, и липам старше 40-45 лет, в связи с повышением риска развития рака желудка.

Недавно проведенное исследование, использовавшее такой подход, показало, что удалось сократить эндоскопии на 20%, причем при этом недиагностировано

было только 2% язв (72), что сопоставимо с процентом ошибок в целом при эндоскопии, и зависит от квалификации специалиста, а не от метода как такового.

Очевидно, что терапия, направленная на уничтожение HP может назначаться серопозитивным больным без проведения эндоскопии, если они не принимают нестероидные противовоспалительные препараты и не старше 40-45 лет, посколькув остальных случаях диспепсия у этой грппы больных обусловлена язвенной болезнью или хроническим гастритом, ассоциированным с HP и адекватная терапиябудет успешной и в том и в другом случае. Что же касается контроля за результатами лечения в этой группе больных, то видимо, следует предпочесть эзофагога-стродуоденоскопию с любым методом определения HP, особенно в том случае,если в процессе лечения врач укрепился в своем подозрении на наличие у данногобольного язвенной болезни.

Хронический гастрит, Л.И. Аруин, 1993