Лабораторная диагностика HPV-инфекции

Длительное время единственным методом ранней диагностики папилломавирусов являлось цитологическое исследование, основанное на поиске характерных для HPV-инфекции цитологических изменений эпителия, таких как коилоцитоз, дискератоз и т. д. [Barasso, 1992; Goodman, 2000]. Однако подобный подход зачастую даёт ошибочные результаты, отличается высоким субъективным компонентом и не выявляет латентные формы HPV-инфекции [Lorincz, 1992; Schneider, Koutsky, 1992; Goodman, 2000]. В целом диагностика HPV стала достоверной лишь с появлением методик, основанных на детекции нуклеиновых кислот — гибридизации ДНК и полимеразной цепной реакции.

Методы детекции HPVна основе гибридизации ДНК. В зависимости от целей и возможностей лабораторий, широко применяются различные техники гибридизации, такие как Саузерн-блот, дот-блот, in situ, filter in situ и т.д. [DeVilliers, 1992; Wick, 2000]. Все они основаны на использовании HPV-ДНК в качестве молекулярного зонда, предварительно меченного радиоактивной или биохимической меткой.

Бесспорными преимуществами в детекции HPVобладает метод Саузерн-блот гибридизации. По сравнению с другими, этот метод характеризуется высокой чувствительностью, специфичностью и информативностью [Wick, 2000]. При осуществлении Саузерн-бло-та клеточная ДНК обрабатывается специфическими эндонуклеазами рестрикции, и полученные фрагменты с помощью электрофореза разделяются в агарозном геле. После денатурации ДНК переносится на мембрану, которая в дальнейшем гибридизуется с меченым HPV-зондом. При оптимальном подборе специфических зондов и условий гибридизации можно получить сведения о физическом статусе HPV-ДНК в клетке, типах HPV, филогенетической взаимосвязи папилломавирусов и т. д. [Lorincz, 1992; Kjaer, Jensen, 1992; Bernard et al., 1994; Wick, 2000].

Недостатками данного метода являются трудоемкость и длительность выполнения процедуры, а также необходимость использования относительно больших количеств биологического материала для анализа. Эти факторы затрудняют использование Саузерн-блот гибридизации для рутинной диагностики и решения задач скрининга.

Гибридизация in situ позволяет установить топографическую взаимосвязь между вирусом и тканью, так как она является единственным методом, который не разрушает морфологию образца. Однако в сравнении с другими техниками гибридизация in situ обладает недостаточной чувствительностью. По данным разных авторов, при использовании такого подхода частота выявления вируса в тканях с субклиническими признаками HPV-инфекции составляет от 0% до 14% [Munoz, Bosch, 1992], в то время как по результатам Саузерн-блот гибридизации этот показатель достигает 36% [Wick, 2000]. При выполнении техники filter in situ клеточный материал (мазок, смыв) отпечатывается на мембране, денатурируется in situ и затем гибридизуется с меченым зондом. К сожалению, данная методика также проигрывает в чувствительности и специфичности по сравнению с остальными [De Villiers, 1992; Wick, 2000].

Следует подчеркнуть, что методики, основанные на реакции гибридизации, менее чувствительны к контаминации, чем ПЦР-диаг-ностика. Поэтому они являются методом выбора в тех условиях, когда правильная организация ПЦР-лаборатории невозможна или когда положительные результаты ПЦР-теста вызывают сомнения.

Методы детекции НРУна основе ПЦР. В течение последнего десятилетия лидирующее место в клинической диагностике HPV-ИН-фекции заняли методы, основанные на проведении реакции ПЦР, что связано с её высокой разрешающей способностью, технической простотой и быстротой данной процедуры [Meijer et al., 1992; Bauer, Manos, 1993].

Первоначально для ПЦР использовались типоспецифические (TS) праймеры, которые амплифицировали ДНК-последовательно-сти строго определенного типа HPV. Более поздние разработки объединяли несколько пар праймеров в одной реакции амплификации [Mitrani-Rosenbaumetal., 1994]. Многочисленные результаты подтвердили высокую чувствительность данных тест-систем, особенно для «он коге иных» типов HPV[Schiffman, 1994]. Однако TS-ПЦР охватывает относительно узкий спектр разновидностей HPV, поэтому её применение имеет определённые ограничения.

Для скрининговых и эпидемиологических исследований более эффективны ПЦР-методы, в которых используются консенсусные (или «общие») пары праймеров [Manos et al., 1989]. С помощью таких праймеров можно выявлять широкий спектр HPV-генотипов, включая новые, неидентифицированныетипы. Наиболее часто используются консенсусные праймеры MY09/11, соответствующие высококонсервативному региону LI генома HPV [Manos et al., 1989]. Они состоят из смеси 25 пар праймеров с несколькими вырожденными нуклеотидами в каждом, что позволяет обнаруживать десятки типов папилломавирусов. Праймеры GP5/6, напротив, имеют фиксированную нуклеотидную последовательность, но все же выявляют не менее 27 типов HPV. Согласно данным сравнительного анализа, частота выявления HPV-последовательностей в MY09/ 11-ПЦР и СР5/6-ПЦР почти одинаковая, но смешанные инфекции в 1,5—2 раза чаще диагностируются с праймерами MY 09/11 [Walboomers et al., 1992].

Молекулярная онкология, клинические аспекты, Е.Н. Имянитов, К.П. Хансон