2.3. Методы исследования биопсийного материала

2.3.1. Подготовка биопсийного материала длягистологического исследования

Кусочки слизистой оболочки, полученные при аспирационной и, особенно, при прицельной гастробиопсии, имеют очень небольшие размеры, которые обусловливают значительные трудности при обработке материала. После фиксации ипроводки по спиртам они сморщиваются, изгибаются и в дальнейшем получитьиз них хорошо ориентированные препараты удается редко.

Для правильной ориентировки биоптатов, предотвращающей получение танге-циальных срезов извлеченный фрагмент слизистой оболочки опускают в чашку Петри с холодной водой. Под кусочек подводят указательный палец и на него препаровальной иглой натягивают и расправляют кусочек слизистой отсеченной поверхностью кверху. После этого, поддерживая за один край фрагмент, переносятего на полоску печени, почки, селезенки или фильтровальной бумаги и накрываютполусферическим проволочным каркасом, который предохраняет от поврежденияповерхностный эпителий и обеспечивает сохранность лежащей на нем слизи (рис.2.1).

Вместо органов животного можно использовать и яблоко плотных сортов (10) или кусочек высушенного огурца, покрытый белком-глицерином и фиксированный в формалине (11).

Вполне удовлетворительные результаты при изготовлении срезов из нефиксированного материала можно получить, применив «сэндвич»; метод (12).

Кусочек застывшей 12% желатины разрезается пополам. В одной половине делается углубление, в которое укладывают отсеченную слизистую, осторожно расправляя ее препаровальными иглами. Затем поверхность разреза обеих половин после согревания теплым шпателем соединяется вновь и полученный «сэндвич»;помещается на столик криостата или замораживающего микротома . Подобныйприем обеспечивает при правильной укладке получение хорошо ориентированных

и удобных для работы срезов, в которых можно не только изучать локализацию липидов и активность различных ферментов, но и использовать препараты послеминутной фиксации в формалине (при 37°С) для срочного гистологического исследования.

Размещение кусочков слизистой оболочки, полученных от одного больного из различных участков или от разных больных на печени или другой подложке, позволяет проводить достоверное сопоставление различных объектов, так как всяобработка их, толщина срезов, время окраски или инкубации будут совершенноидентичны (рис. 2.2).

Для маркировки объектов первый кусочек укладывается вплотную к одному концу подложки, от последнего кусочка до второго конца ее остается небольшоерасстояние. С помощью такого приема под микроскопом можно легко распознать каждый препарат, номера которых указываются в направлении на гистологическое исследование (рис. 2.1).

Маркировка позволяет патологоанатому рекомендовать эндоскописту в сомнительных случаях повторную биопсию из того участка, из которого был иссечен кусочек, вызвавший какие либо подозрения.

2.3.2. Фиксация и заливка.|

Для фиксации материала биопсий применяется 10% нейтральный забуференный по Лилли формалин.

Фиксирующие свойства забуференного формалина улучшает добавление 2% фенола. Это уменьшает сморщивание клеток и их ядер, а также предотвращает отложение формалинового пигмента (13).

Биоптаты можно фиксировать в жидкости Карнуа в течение 15-20 мин. При этом не только ускоряется обработка материала, но и обеспечивается лучшее качество препарата. Особенно хорошо при использовании этого метода выявляетсяструктура ядер. Для выявления эндокринных клеток рекомендуется фиксация вжидкости Буэна. Если предполагается изучение тучных клеток, то следует учитывать что тучные клетки слизистой оболочки желудка и кишечника почти не выявляются (в отличие от тучных клеток, расположенных в других слоях) после фиксации в формалине. В этих случаях материал следует фиксировать в жидкости Карнуа, или в растворе Мота в течение 24 часов (основной ацетат свинца 1,0 спирт50 мл, дистилированная вода 50 мл., ледяная уксусная кислота 0,5 мл.). В 1 ммслизистой оболочки тонкой кишки после фиксации в формалине выявлено 40 тучных клеток, после фиксации в жидкости Карнуа — 268 (14).

2.3.3. Окраска и гистохимические реакции.

Состояние слизистой оболочки достаточно полно можно оценить при окраске ге-

i.i i оксилином и эозином. При изучении опухолей, язв и полипов требуется окрас-‘ .1 по ван Гизону.

Для элективной окраски слизистой оболочки желудка предложено много к- годик.

Наиболее простой и достаточно информативной является окраска азур-эозином но Лилли. По этому методу в синий цвет окрашиваются ядра, цитоплазма главных клеток, рибонуклеопротеиды, в сине-фиолетовый — тучные клетки и гранулык-йкопитов, в ярко-розовый — цитоплазма мышечных волокон и некротизированных клеток, в розово-красный — гранулы клеток Панета, в розовый — цитоплазма париетальных клеток, в оранжево-красный — эритроциты. Окраска мукоидаварьирует от бледного зеленовато-синего до сине-фиолетового (15).

Окраска слизистой желудка по В.А. Самсонову (1973) основана на сочетании 111ИК-реакции с обработкой срезов реактивом Романовского-Гимзы (16).

Ядра при этом голубые или темно-синие, секрет поверхностного и ямочного шителия — темно-фиолетовый, клеток шеечного отдела и пилорических желез —малиново-красный. Париетальные клетки бледно-розовые, главные — сиреневогоцвета, муцин бокаловидных клеток — фиолетово-красный, эозинофилы — оранжево-красные, цитоплазма плазматических клеток — темно-сиреневая. В тучныхклетках видны темно-фиолетовые гранулы.

Следует отметить, что при хорошем качестве препаратов все клеточные элемен-I ы желез желудка могут быть выявлены и при окраске гематоксилином и эозином.

Ценную информацию о состоянии слизистой оболочки желудка и кишечника даст ШИК-реакция. С ее помощью можно оценить секреторную функцию поверхностного и ямочного эпителия, распространение добавочных и «мукоидизацию»; I лавных клеток, выявить очаги кишечной метаплазии. ШИК реакция имеет и важное диагностическое значение, так как позволяет выявить в некоторых сомнительных случаях секрет в опухолевых клетках. Это особенно важно для диагностикираннего рака. Ни ксантомные клетки, ни тельца Русселя, ни клетки, характерныедля малакоплакии желудка не окрашиваются, в отличие от перстневидных клеток,при ШИК-реакции.

Одновременное выявление кислых и нейтральных гликозаминогликанов в одном срезе производится окраской ал циановым синим и ШИК-реакцией. Кислые гликозаминогликаны окрашиваются в голубой цвет, нейтральные — в красный,смесь этих соединений — в различные оттенки фиолетового. Непременным условием этой методики является окраска алииановым синим до ШИК-реакции. В противном случае алциановый синий окрашивает элементы, содержащие нейтральные гликозаминогликаны.

Для дифференцированного выявления углеводосодержащих биополимеров может быть использована окраска орсеином в сочетании с алциановым синим (17).

Приготовление реактива:

Орссин — 1,0

70/u спирт — 100 мл.

концентрированная HCL — 1 мл.

Окраска:

1. Депарафинированные срезы довести до воды.

2. Окисление в 0,25% перманганате калия в 0,25% серной кислоте.

3. Обесцвечивание в 2% щавелевой кислоте.

4. Промывание в проточной воде.

5. Окраска в растворе орсеина — 4 часа.

6. Промывание в воде.

7. Дифференциация в подкисленном 70% спирте — 2-3 сек.

8. Промывание в воде.

9. Окраска в 1% алциановом синем в 3% уксусной кислоте (pH 2,5) — 1 мин.

10. Обезвоживание в спиртах, просветление, заключение в бальзам.

Результаты: сульфомуцины окрашиваются в коричневый цвет, сиаломуцины — в синий.

С помощью реакции Браше можно оценить состояние регенераторных процессов в слизистой оболочке, установить степень плазмоклеточной инфильтрации. Кармин Беста позволяет отличить «зрелый»; мукоид от «незрелого»;.

Оптимальным методом идентификации эндокринных клеток является метод иммуноморфологии, но для получения достоверных результатов необходимы нетолько высокоспецифические антисыворотки, но и строгое соблюдение ряда правил, принятых в современной иммунологии.

При фиксации материала главное — сохранение антигенности ткани. Хорошие результаты достигнуты с помощью фиксирующей смеси Буэна без уксусной кислоты (18). Формалин, как известно, связывается с белками тканей, что приводитк маскировке антигенных участков. Для разрушения межмалекулярных связей ираскрытия доступа антител к антигенным участкам применяется обработка срезов проназой или трипсином. Усиливает антигенность ткани и нагревание парафиновых срезов до 60°С в течение 2 часов и удлинение обработки в ксилоле.

При всех иммуноморфологических реакциях необходимы контроля на специфичность антител. Для этого заменяют первичную специфическую антисыворотку нормальной неиммуной сывороткой или другой специфической антисывороткой, а так же проводят абсорбцию антител избытком специфического антигена.

Дальнейшая обработка материала включает использование ПАП или авидин-биотинового методов (18).

Иммуногистохимические методы не позволяют все же выявить пептиды, содержащиеся в клетке в низких концентрациях.

Новые возможности изучения функциональной морфологии эндокринных клеток открывает метод гибридизации in situ. Комплементарные нуклеотидные последовательности меченые радиоактивными или нерадиоактивными веществами (например биотином) позволяют обнаружить молекулы специфической мРНК игем самым — экспрессию генов в клетке. По различным уровням отношениямРНК/пептиды можно судить о функциональном состоянии эндокринных клеток(19,20).

При отсутствии специфических антисывороток эндокринные клетки можно выявлять путем серебрения. Применяя набор аргентаффинных и аргирофипьных реакций удается даже идентифицировать отдельные типы эндокриноцитов (табл.2.1).

Наиболее универсальной считается реакция Гримелиуса, которая выявляет почти все эндокринные клетки желудочно кишечного тракта. В связи с этим реакцией Гримелиуса пользуются для оценки наличия эндокринных клеток в различных тканях, в том числе и для диагностики апудом. D.M. Smith и R.C. Haggitt (1983)сравнили информативность ряда аргирофильных и аргентаффинных методик приидентификации эндокринных клеток в карциноидах. Наиболее информативным,по их данным, оказался метод импрегенации Churukian-Schenk, который выявилэндокринные клетки в 97% карциноидов, метод Гримелиуса — в 79%, Севиера-Мунге — в 74%, Фонтана-Массона — в 51 %, окраска свинцовым гематоксилином— в 67% (21).

Метод импрегнации по Churukian-Schenk в отечественной литературе не описан, поэтому мы считаем возможным его привести.

Приготовление реактивов.

1. Подкисленная вода:

Дистиллированная вода — 500 мл.

0,3% лимонная кислота до получения pH 4,2,

2. 0,5% нитрат серебра:

нитрат серебра 0,5, подкисленная вода 100 мл.

3. Проявляющий раствор Бодиана:

Сульфат натрия безводный 5,0 Гидрохинон 1,0

Дистиллированная вода 100 мл.

4. 0,1% ядерный прочный красный:

Ядерный красный прочный 0,1

5% сульфат аммония 100 мл. (растворяется при нагревании)

После охлаждения профильтровать, добавить несколько гранул тимола.

Окраска.

1. Депарафирированные срезы перенести в подкисленную воду.

2. 0,5% нитрат серебра в водяной бане (43°С) — 2 мин. Затем поместить бюксс препаратами в водяную баню (58 °С) — 2 ч.

3. Промыть в 3-х сменах дистиллированной воды.

4. Проявитель Бодиана предварительно подогретый в водяной бане (58°С) — 5мин.

5. Промыть в 3-х сменах дистиллированной воды.

6. Промыть в проточной воде — 3 мин.

7. Промыть в 3-х сменах дистиллированной воды.

8. Поместить в тот же раствор нитрата серебра в водяной бане (58″;С) — 10 мин.

9. Промыть в 3-х сменах дистиллированной воды.

10. Перенести в тот же проявитель Бодиана (58°С) — 5 мин.

11. Промыть в 3-х сменах дистиллированной воды.

12. Подкрасить 0,1% ядерным прочным красным — 3 мин.

13. Промыть в 3-х сменах дистиллированной воды.

14. Обезвоживание в спиртах и ксилоле, заключение в бальзам.

Результаты: гранулы эндокринных клеток — коричневые, ядра — красные. Сравнительно простая методика выявления аргирофильных клеток предложена

W. Carvey и соавт. (1989) (22).

Фиксация в 10% нейтральном забуфференном формалине — 2 суток — 2 недели. Реактивы:

1. Пикриновая кислота — 8,0Абсолютный спирт — 100 мл.

(Для удаления формалиновых осадков)

2. Нитрат серебра — 0,1Деионизированная вода — 10 мл.

3. Gum mastic — 2,5i

Абсолютный спирт — 100 мл.

(Коллоидный раствор для предупреждения преципитации серебра).

4. Гидрохинон — 0,5Деионизированная вода — 30 мл.

(Готовится перед использованием)

5. Раствор гидрохинона (п.4) — 30 мл.

Раствор Gum mastic (п.З) — 10 мл.

Раствор нитрата серебра (п.2) — 1,1 мл.

(Готовится перед погружением срезов)

6. Тиосульфат натрия — 1,0Деионизированная вода — 100 мл.

7. Ядерный прочный красный — 0,1

5% водный раствор сульфата аммония — 100 мл.

Растворить при нагревании, охладить, профильтровать, добавить кристалл титла для консервации.

11римечания:

I. Посуду и стекла обработать азотной кислотой для предотвращения преципитации серебра.

’. Деионизированная вода желательна, но может быть заменена бидистиллиро-ванной.

1. Устранить контакт с металлом.

Окраска:

1. Депарафинировать срезы и довести их до воды.

2. Промыть в деионизированной воде — 4 смены.

1. Промыть в 95%, затем в абсолютном спирте.

4. Gum mastic (п.З) — 3 мин.

5. Просушить и поместить в раствор для импрегнации (п.5) в водяной бане(60°С) — 18-20 мин.

6. Промыть в абсолютном спирте — 2 смены.

7. Промыть в деионизированной воде.

8. Раствор тиосульфата натрия (п.6) — 2 мин.

9. Промыть в проточной воде-

10. Раствор ядерного прочного красного (п.6) — 30 сек.

11. Обезводить в спиртах, просветлить, заключить в бальзам.

Результаты: Аргирофильные клетки, некоторые бактерии, кальций, медь —

черные, ядра — красные. Результаты сходны с таковыми при реакции Гримелиу-i а и при иммуноцитохимическом выявлении хромогранина, но методика занимает меньше времени (20 мин. вместо 3 ч.) и не требует двойной импрегнации.

Для ориентировочной идентификации различных типов апудоцитов можно использовать 4 несложных методики импрегнации серебром (табл.2.1).

Все эти методики описаны в руководствах по гистохимии.

Необходимо напомнить, что для получения надежных результатов необходимо использовать идеально чистую посуду и бидистиллированную воду. Полезно,особенно на первых порах, вместе с исследуемым материалом окрашивать и эта-зонные срезы из ткани, в которой до этого реакция была достаточно отчетливой.Этот прием сразу объяснит отсутствие окраски в препаратах: если ее нет и в исследуемых и в эталонных срезах, то нужно искать какие-то нарушения методики.

При проведении реакции Гримелиуса рекомендуют в отличие от первоначального описания ее увеличить концентрацию нитрата серебра с 0,03% до 0,07%, а температуру восстанавливающего раствора с 40°С до 55°С. Если клетки окрасились слабо следует провести повторную импрегнацию, поместив срезы в свежеприготовленный раствор нитрата серебра при комнатной температуре на 15 мин.,

а затем в свежеприготовленный восстанавливающий раствор на 1 мин. при 55°С (состав этих растворов такой же как и на первом этапе).

ECL клетки хорошо окрашиваются по Севиер-Мунге. Однако, окрашиваются при этом и EC-клетки. Предлагают определять количество ECL клеток путем вычитания из аргирофильных (по Севиер-Мунге) клеток, реагирующих с антисывороткой к серотину (23). Той же цели можно достичь, заменив иммуноморфологи-ческую реакцию на аргентаффинную.

Для суммарного выявления эндокринных клеток используют так называемые маркерные методики (нейронспецифическая эполаза и белок S-100).

Таблица 2.1. Аргентаффинные и аргифильные реакции различных типов эндокринных клеток желудочно-кишечного тракта человека.

клеток

Г о р м о н

методики

Массона

Г римелиуса

Севиер-

Мунге

Давен

порта

Бомбезин-подобный

Серотонин + вещество Р

+ + +

+ + +

+ + +

ес2

Серотонин + мотилин

+ + +

+ + +

+ + +

Неизвестен

+ Х

Панкреатический полипептид

Соматостатин

+ + +

Глюкагон

+ + +

Неизвестен

Г истамин

+ + +

+ + +

Г астрин

Секретин

Холецистокинин

Желудочный ингибирующий пептид

+ + +

+ + +

Нейротензин

Глицентин

+ + + -выраженная реакция, + + -умеренная реакция, + -слабая реакция, ( + ) -практически

не реагирует, ± -иногда слабая реакция, иногда не реагирует,—не реагирует, х -желудок,

и — толстая кишка.

Хронический гастрит, Л.И. Аруин, 1993