Поиск новых генов

и молекулярная классификация опухолей

Одним из наиболее важных аспектов применения высокопроизводительных технологий в онкологии является поиск новых кандидат-ных генов и диагностических маркеров. Существует большое число примеров, когда применение cDNA-arrays, чаще всего в сочетании с другими методиками, способствовало выявлению ранее неизвестных генетических элементов, участвующих в процессах онкогенеза.

В одной из первых работ подобного плана при анализе большого числа образцов плоскоклеточного рака лёгкого был идентифицирован блок генов, экспрессия которых характерна именно для этого конкретного типа опухолей легкого [Wang et al., 2000]. Данная группа генов была расценена как одна из перспективных терапевтических мишеней.

В другой работе использовали cDNA-arrays для скрининга различий в генной экспрессии между резистентными и чувствительными к гормонотерапии опухолями предстательной железы. При этом в гормонорезистентных опухолях была выявлена гиперэкспрессия двух генов: белка инсулиноподобного фактора роста 2 (IGFBP2) и 27-kd белка теплового шока (HSP27) [Bubendorfetal., 1999]. Последующий иммуногистохимический анализ продуктов этих кандидат-ных генов показал, что гиперэкспрессия IGFBP2 белка обнаруживается в 100% гормонорезистентных опухолей, в 36% первичных опухолей и не выявляется при доброкачественных аденомах предстательной железы. Усиленная экспрессия HSP27 белка обнаружена в 31% опухолей, устойчивых к гормонотерапии, 5% первичных опухолей, и также не определялась в доброкачественных новообразованиях. Таким образом, методом сDNA-arrays удалось идентифицировать гены, играющие ключевую роль в приобретении опухолью свойства андроген-независимости.

Помимо рака предстательной железы, повышенная экспрессия гена IGFBP2 выявлена в глиомах высокой степени злокачественности [Fuller et al., 1999]. Известно, что активность данного гена обнаруживается в головном мозге человека лишь на стадии эмбрионального развития; во взрослом организме IGFBP2 полностью отсутствует, так что его обнаружение служит специфическим маркером злокачественной трансформации.

Исследование генетического профиля различающихся по метастатическому потенциалу меланом кожи показало, что ключевая роль в метастазировании данной опухоли принадлежит гену ГТФ-азы RhoC. Взаимосвязь между уровнем экспрессии данного гена и ме-тастазированием подтвердилась также в опытах на культурах клеток меланомы, в которых экспрессия доминантно-летального мутанта RhoC полностью подавляла их способность к активному ме-тастазированию [Clark et al., 2000].

На клеточных линиях рака толстой кишки с помощью техники SAGE установлено участие транскриптов нескольких генов в поддержании метастатического потенциала этих клеток. Среди них следует упомянуть такие, как кератин К5, цистатин S, сывороточный амилоид А, гомолог дрожжевой S28 рибосомной РНК, р32 субъединицу сплайсинг фактора SF2 [Parle-McDermott et al., 2000]. Применение SAGE позволило также обнаружить ранее неизвестные маркеры рака поджелудочной железы. Оказалось, что транскрипционный профиль данной опухоли отличается от гомологичной нормальной ткани по уровню экспрессии, по крайней мере, 138 генов. Одним из генов, относящихся к данной группе, является ген тканевого ингибитора металлопротеиназы первого типа, продукт которого представляет собой секретируемый белок; его обнаружение в сыворотке крови может служить диагностическим маркером рака поджелудочной железы [Zhou et al., 1998].

Выполнен ряд работ, направленных на воссоздание молекулярного портрета одной из наиболее изученных опухолей человека — рака молочной железы [Liotta, Petricoin, 2000; Bertucci et al., 2003]. РМЖ отличается исключительно высокой гетерогенностью как по своим клиническим проявлениям, так и по чувствительности к терапевтическим воздействиям. Perou и соавт. использовали cDNA arrays анализ для характеристики транскрипционного профиля РМЖ [Perou et al., 1999; Perou etal., 2000]. Двенадцать опухолей исследованы до и после проведения лечения доксорубицином, а две карциномы сравнивали с их метастазами в лимфатические узлы. Удалось обнаружить целый ряд различий генетического профиля между отдельными образцами опухолей. Другой задачей данного исследования была разработка системы молекулярной классификации РМЖ. Авторы выделили кластер, состоящий из 496 генов, экспрессия которых в РМЖ характеризуется значительными отличиями по сравнению с нормальной тканью. На основании анализа профилей экспрессии генов в указанном кластере, образцы опухолей удается подразделить на две группы, соответствующие двум клинически различным типам РМЖ: положительному и негативному по эстрогеновым рецепторам (ЭР). Кроме того, ЭР-положитель-ные опухоли отличались усиленной экспрессией некоторых генов, характерных для клеток наружной эпителиальной выстилки протоков, и практически не экспрессировали HER2 онкоген. Многие транскрипты, специфические для базального слоя протокового эпителия, интенсивно экспрессировались преимущественно в ER-ot-рицательных карциномах. Обнаруженные отличия, по-видимому, могут иметь большое значение для предсказания эффективности лечения и прогноза, однако для окончательного вывода необходимы дальнейшие исследования.

Помимо рассмотренного выше исследования, выполнена целая серия работ, специально посвященных транскрипционной классификации морфологически неразличимых подтипов опухолей. Впервые различия профилей экспрессии генов были обнаружены при

сравнении разных линий опухолевых клеток, культивируемых in vitro [Khan et al., 1998]. В дальнейшем аналогичные данные были получены при сопоставлении cDNA-arrays клеток миелоидного и лимфоидного лейкозов [Golub et al., 1999] и двух субтипов крупноклеточных В-лимфом [Alizadeh et al., 2000]. Что касается РМЖ, то большой интерес представляют данные об особенностях транскрипционных профилей спорадических и генетически наследуемых опухолей. Хорошо известно, что характерным свойством наследственного РМЖ является наличие мутаций в генах BRCA1 и BRCA2, однако оказалось, что этим различия между двумя типами РМЖ не ограничиваются. В работе Hedenfalk и соавт. (2001) установлено, что опухоли, несущие мутации в BRCA1 и BRCA2 генах, отличаются не только от спорадических опухолей, но и друг от друга. Авторы идентифицировали кластер, состоящий из 51 гена, особенности экспрессии которого позволяют судить о наличии мутаций в BRCA1 и 2. Установление данного факта значительно упрощает диагностику наследственных форм РМЖ, так как исключает необходимость проведения сложной и дорогостоящей процедуры секвенирования весьма протяженных генов BRCA1 и BRCA2. Bittner и соавт. (2000) на основе иерархического кластеринга генной экспрессии разработали новый принцип классификации меланом. Оказалось, что особенности регуляции некоторых генов в клетках меланомы достаточно четко отражают такие важные их свойства, как агрессивность и способность к метастазированию.

Sgroi и соавт. (1999) использовали cDNA-arrays в сочетании с лазерной диссекцией (LCM) для идентификации генов, уровень экспрессии которых изменяется при переходе РМЖ к метастазированию. При сканировании 8092 последовательностей обнаружено 90 генов, экспрессия которых претерпевает, по крайней мере двукратное изменение активности в метастазирующих клетках. Наряду с известными генами, имеющими отношение к РМЖ, такими как гены BRCA, обнаружены колебания экспрессии некоторых последовательностей, относительно далеких по своим предполагаемым функциям от онкогенеза. Среди последних можно назвать гены, кодирующие аполипопротеин D, аннексии 1 и малый индуцибельный цитокин А5. Все эти гены, как известно, ассоциированы с мотиль-ностью и хоумингом иммунокомпетентных клеток, функции которых напрямую не связывали с опухолевым ростом. В другой работе [Leethanakul et al., 2000] сочетание методов cDNA-arrays и LCM применяли для выявления генов, ассоциированных с прогрессией плоскоклеточных карцином головы и шеи. Авторы установили, что большинство опухолей характеризуется высоким уровнем экспрессии генов семейств WNT и NOTCH, участвующих в процессах регуляции роста и дифференцировки клеток.

Сравнительный анализ профилей экспрессии генов в образцах, взятых из разных участков опухоли, открывает перспективы для более тонкого и углубленного понимания механизмов прогрессии злокачественных новообразований. Cole и соавт. (1999) на основании такого рода данных предложили трехмерную модель экспрессии генов в разных участках индивидуальной опухоли. Данная модель позволяет идентифицировать те ключевые гены, от экспрессии которых зависит переход от морфологически выявленных предраковых изменений к истинно инвазивному росту опухоли.

Большой интерес представляют попытки описания так называемого молекулярного портрета опухолей отдельных локализаций и поиски его корреляций с клиническими параметрами злокачественных новообразований. Например, на основании клинических и гистологических данных описаны два субтипа рака эндометрия (РЭ) [Deligdisch, Holinka, 1987]. Тип I РЭ относится гистологически к высокодифференцированным эндометриоидам. Пациенты, страдающие РЭ первого типа имеют относительно благоприятный прогноз. В противоположность этому, тип II РЭ относится гистологически к недифференцированным неэндометриоидным опухолям и характеризуется ранним метастазированием и агрессивным течением заболевания.

Опубликованы результаты cDNA arrays анализа указанных двух типов РЭ [Risinger et al., 2003]. Авторы работы исследовали профиль экспрессии в 19 эндометриоидных раках, 16 неэндометриоидных опухолях и 7 образцах нормального эндометрия. При этом обнаружен 191 ген, экспрессия которого различается более чем двукратно между РЭ I и II типов. Кроме того, было установлено, что оба типа опухолей отличаются по характеру экспрессии генов от нормальной ткани эндометрия.

Молекулярная онкология, клинические аспекты, Е.Н. Имянитов, К.П. Хансон