Разработка высокопроизводительных (high-throughput) технологий и функциональная онкогеномика

Несмотря на исключительную сложность проблемы, международные усилия исследователей завершились секвенированием 3,2 миллиардов пар оснований генома человека [Collins, Mansoura, 2001; Gerrero, Weber, 2001 ]. Тем не менее ограничения в поиске кан-дидатных генов при онкогенезе сохраняют свою значимость. Предполагается, что геном человека содержит около 35 тысяч генов

[Baltimore, 2001]. Однако функциональное значение большинства из них по-прежнему остаётся неизвестным [Gabrielson et al., 2001 ]. Разработан целый ряд высокоразрешающих технологий, которые позволяют охарактеризовать одновременно большое число генов и выяснить их роль при различных заболеваниях, в том числе при злокачественных новообразованиях.

Большинство современных технологий основано на измерениях, проводимых на уровне мРНК, хотя все большее развитие начинают получать исследования, выполняемые на уровне белков (про-теомика) [Lawrie et al., 2001]. Некоторые из новых методических разработок оказываются на практике технически сложными; это относится, например, к серийному анализу экспрессии генов, субтрактивной гибридизации и фингерпринтингу кДНК фрагментов. В то же время техника «кДНК-панелей» (cDNA-arrays) находит все более широкое применение, втом числе и в клинических исследованиях, благодаря сравнительной дешевизне, простоте и стандартности [Bertram, 2000].

Метод «кДНК-эррейз» основан на иммобилизации на подложках множества коротких отрезков односпиральной ДНК, [Khrapko et al., 1989]. Как cDNA-arrays [Lockhart and Winzeler, 2000], так и серийный анализ экспрессии генов (SAGE) [Velculescu et al., 2000] способны одновременно определить экспрессию большого числа генов в клеточной популяции, например, в конкретном образце опухоли. Тысячи образцов кДНК или олигонуклеотидов автоматически наносятся на твердую основу в упорядоченном виде, или же олигонуклеотиды синтезируются непосредственно на матрице [Lipshutz, Fodor, 1999]. Эти прикрепленные к матрице ДНК, соответствующие множеству генов, называют пробами. С целью определения представительства генов из анализируемого образца ткани выделяют тотальную РНК и синтезируют кДНК в реакции обратной транскрипции. В ходе данной реакции кДНК метят с помощью флуоресцентного красителя или радиоактивного изотопа и получают так называемые мишени (targets). Мишени затем гибридизуют с пробами на микрочипах. После детекции сигналов с помощью лазерного сканера профили экспрессии подвергают математическому анализу [Zhang et al., 2001].

Одним из существенных ограничений cDNA-arrays является тот факт, что они образуют закрытую систему, т. е. каждое определение может дать информацию только о тех генах, которые включены в array. В противоположность этому, SAGE представляет собой открытую систему и обладает тем преимуществом, что последовательности, состоящие из 9—10 нуклеотидов (tags), содержат достаточно информации для идентификации генов. Секвенирование tags позволяет определять частоту, с которой каждая такая последовательность представлена в библиотеке. Данная частота отражает относительную величину экспрессии гена в клетке [Zhang et al., 2001]. Как отмечалось выше, SAGE — значительно более трудоемкий метод по сравнению с cDNA-arrays. На практике только 10—20% всех tags соответствуют уникальным генам. Следовательно, для того чтобы выявить редко повторяющиеся гены, необходимо просеквенировать значительно большее число tags. Например, чтобы получить информацию о 5 тысячах генов, требуется просеквенировать 50 тысяч tags [Velculescu et al., 1954]. Так же как и в случае с cDNA-arrays, существует целый ряд вариантов SAGE. Мини-SAGE, например, позволяет получить информацию о профиле генной экспрессии при наличии всего лишь 1 мкг тотальной РНК [Ye et al., 2000].

Сравнительная геномная гибридизация (CGH) применяется при скрининге генома, прежде всего для построения физических карт участков хромосомы, характеризующихся делецией или амплификацией. Однако для более точной локализации хромосомных нарушений используют CGH array, отличающийся большей высокой разрешающей способностью. Для поиска участков хромосомы, в которых располагаются делеции или амплификации, геномную ДНК из опухоли и нормальных клеток метят двумя разными флуо-рофорами и затем ко-гибридизуют с панелью ДНК-зондов. Техника CGH arrays позволяет быстро идентифицировать те гены, которые вовлечены в хромосомные аберрации [Kallioniemi et al., 1992; Davidson et al., 2000; Zhang, Laborde, 2001].

Внедрение высокопроизводительных методов позволяет получить цитогенетические характеристики злокачественных клеток, ранее недоступные анализу. Так, исследования, проведенные с помощью сочетания CGH с обычным G-banding и полным окрашиванием хромосом, позволили воссоздать генетическую картину для двух линий клеток рака толстой кишки, хромосомные аберрации в которых ранее не были описаны [Masramon et al., 2000].

Современная высокопроизводительная технология анализа на тканевом уровне (tissue microarray) позволяет получить информацию о нарушениях, лежащих в основе процессов развития и прогрессии опухоли. Уникальность данной методики заключается втом, что она дает возможность исследовать большое число образцов опухолей человека. Tissue microarray (ТМА) удается успешно выполнить при доступности минимального количества опухолевого материала, заключенного в парафиновые блоки. При этом не повреждается основной блок, так как диаметр отбираемого образца не превышает 0,6 мм. Подобным способом возможно объединять до 600 разных опухолей в одном суммарном блоке и подвергать его array анализу. Этот подход позволяет проводить скрининг разнообразного биопсийного материала с целью выявления новых диагностических или прогностических маркеров [Moch et al., 1999; Bubendorf et al., 2001].

Одной из важных проблем, возникающих при изучении генетического профиля опухолей, является неоднородность клеточного состава опухолей и их значительная генетическая гетерогенность. Исходя из сказанного, необходимо тщательно охарактеризовывать морфологические образцы тканей, используемые для молекулярнобиологических исследований. Одним из путей преодоления тканевой гетерогенности является использование методов выделения однородных популяций клеток. До недавнего времени применяли разные подходы для получения гомогенных клеток, в частности такие как ручная диссекция, автоматическая сортировка, отбор на основании поверхностных рецепторов и культивирование на селективных средах. Однако в настоящее время наиболее эффективной методикой указанного плана является лазерная микродиссекция (laser capture microdissection, LCM) [Emmert-Bucketal., 1996]. Большинство патоморфологов полагает, что характеристика экспрессии генов в клетках опухолей, проводимая с помощью cDNA-array, может дать адекватные результаты только в том случае, если в эксперименте используются клетки, полученные с применением LCM [Going, Gusterson, 1999]. Следует, однако, заметить, что изучение лишь специально отобранных опухолевых клеток страдает известной односторонностью и не отражает полностью сложную картину

опухолевого роста. Очевидно, что опухолевые клетки не существуют изолированно, и рост опухоли происходит во взаимодействии с окружающей стромой, лимфоцитами и эндотелием, причем эти неотъемлемые компоненты опухоли входе прогрессии также претерпевают генетические изменения [St Croix et al., 2000].

Завершая рассмотрение методического анализа проблемы, отметим, что хотя обсуждение роли биоинформатики выходит за пределы настоящего обзора, эта проблема чрезвычайно важна для достижения успеха при применении современных высокопроизводительных технологий [Kuklin et al., 2000]. Внедрение ФОГ в молекулярную онкологию потребовало совершенно нового уровня взаимодействия между клиницистами, биологами, математиками и специалистами в области компьютерных технологий, и эта тенденция, несомненно, будет усиливаться в будущем.

Молекулярная онкология, клинические аспекты, Е.Н. Имянитов, К.П. Хансон