ЗАГАЛЬНІ ПРИНЦИПИ ДІАГНОСТИКИ ІНФЕКЦІЙНИХ ХВОРОБ

Діагностика інфекційних хвороб грунтується на клінічних діагностичних засадах і методах, що використовуються у внутрішній медицині та відомі з курсу пропедевтики, однак існують певні особливості. Так, при обстеженні хворого інфекційного профілю додатково до інших видів анамнезу збирають епідеміологічний анамнез — відомості про можливість передачі інфекції від джерела інфекції до хворого, можливі фактори (шляхи) передачі збудника, тривалість інкубаційного періоду. Наявність виявлених чинників епідеміологічного анамнезу дає можливість у випадках певних інфекційних хвороб (ботулізму, правця, сказу та ін.) установлювати діагноз (часто остаточний) шодо наявності такої інфекційної хвороби. Так, у пацієнта з підозрою на правець (виникнення його клінічних ознак) установлення наявності забрудненої рани (епідеміологічний чинник) цілком достатньо для переведення ймовірного діагнозу в градацію підтвердженого випадку.

Методи неспецифічної лабораторної та інструментальної діагностики в цілому є спільними з іншими галузями медицини. Проте наявність у розвитку7 інфекційної хвороби певного збудника дає можливість підтвердити діагноз шляхом виявлення його або його часток —антигенів, токсинів тощо, а також імунологічних реакцій у відповідь на його потрапляння в організм (вироблення антитіл, реакції гіперчутливостї та ін.). У клініці інфекційних хвороб застосовують такі методи специфічної діагностики:

— для виявлення самого збудника:

• мікроскопічний (пряма й непряма світлова мікроскопія, електронна мікроскопія; бактеріоскопія, паразитоскопія, у тому числі ово- та гельмінтоскопія, вірусоскопія);

• бактеріологічний (посів крові, випорожнень, сечі, мокротиння та інших рідин організму на штучні поживні середовища, у культури клітин або тканин для виявлення бактерійних збудників);

• вірусологічний (посів на курячий ембріон, у культури клітин або тканин);

• біологічний (уведення в організм лабораторних тварин різних рідин від хворого з метою спричинити в них розвиток інфекції, виділити збудника у великій кількості для ідентифікації та вивчення властивостей);

14

ЗАГАЛЬНІ ПРИНЦИПИ ДІАГНОСТИКИ ІНФЕКЦІЙНИХ ХВОРОБ

— для виявлення антитіл, антигенів, геномів збудника або продуктів його життєдіяльності:

• серологічний (виявлення антитіл у реакції аглютинації (РА), реакції зв’язування комплементу (РЗК), реакції непрямої гемаглютинації (РИГА), за допомогою радіоімунного (РІА) й імуноферментного аналізу (ІФА) тощо);

• виявлення антигенів, нуклеїнових кислот реакція імунофлюоресцснції (РІФ), ІФА, РІА, полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), молекулярне клонуван-ня тощо);

• газова хроматографія;

• імунохроматографічні тести (експрес-діагностика);

• реакції гіперчутливості вповільненого типу (внутрішньошкірні проби при туляремії та ін.);

• реакція нейтралізації токсину при ботулізмі, яку проводять на лабораторних мишах.

Для виявлення збудника інфекційної хвороби використовують мікроскопічний метод — пряме або непряме виявлення патогенного мікроорганізму в тканинах ураженого макроорганізму. Пряме мікроскопічне дослідження рідин, ексудатів і тканин є одночасно найпростішим і одним із найінформативніших лабораторних методів, що їх застосовують у діагностиці інфекційних хвороб. У багатьох випадках це дослідження дає змогу провести точну, високоспецифічну ідентифікацію етіологічного агента. Прикладом є розпізнавання плазмодіїв у мазках крові, отриманих від хворих на малярію. При прямій мікроскопії використовують безліч методик. Якшо мікроорганізм має великі розміри або характерну морфологію, із досліджуваного матеріалу можна приготувати незабарвлені нативні препарати й дослідити в світлому, темному полі або за допомогою фазово-контрастної мікроскопії. Набагато частіше для прямої мікроскопії готують висушені мазки — це дає можливість застосувати різноманітні забарвлення, які полегшують виявлення та ідентифікацію мікроорганізму.

Нативні препарати часто використовують для діагностики грибкових і паразитарних інфекцій. Прикладами є криптококовий менінгіт (діагноз установлюють при виявленні інкапсульованого мікроорганізму в препараті спинномозкової рідини, пофарбованому індійським чорнилом) і кокиидіоїдоз, ідентифікований за наявності в мокротинні хворого характерних сферул. Дослідження нативних препаратів випорожнень або дуоденального вмісту також є початковим етапом у встановленні діагнозу кишкових паразитарних інфекцій, таких як амебіаз і криптослоридіоз, кишкових гельмінтозів (ово-, мікроскопія тіл або фрагментів самих гельмінтів). На підставі виявлення характерних рухів мїкрофі-лярій і трипаносом у крові та інших рідинах організму можуть бути розпізнані філяріоз і трипаносомоз.

Фарбування за Грамом і після 100 років застосування залишається найкращим і єдиним широкодоступним методом швидкої діагностики бактерійних інфекцій. Його використовують при дослідженні фактично всіх видів клінічних матеріалів, причому найбільшу цінність цей метод має при дослідженні ексудатів, аспіратів і тканинних рідин, включаючи спинномозкову рідину і сечу. Бактерії мають вигляд або темно-синіх (грампозитивні), або рожевих (грамнегативні) тіл. їх забарвлення і морфологічні особливості часто уможливлюють попередню ідентифікацію роду, а іноді й виду мікроорганізму. Деякі специфічні мікроорганізми

15

ЗАГАЛЬНА ІНФЕКТОЛОГІЯ

можна виявити при фарбуванні за іншими методиками (із флюорохромами, за Гімзою тощо).

Електронно-мікроскопічне дослідження використовують для ідентифікації тих вірусів, що не мають шггопатичного ефекту в культурі клітин. Воно особливо цінне для виявлення ротавірусів у випорожненнях немовлят і дітей раннього віку, які хворі на гастроентерити. Велика кількість і характерна морфологія цих вірусних частинок дають змогу провести їх специфічну ідентифікацію на підставі одних лише морфологічних ознак. Електронна мікроскопія також може бути використана для діагностики хвороб, спричинених вірусами Norwalk.

Незважаючи на складність виконання і необхідність певного періоду часу для отримання результату, виділення етіологічного агента за допомогою культивування на штучних поживних середовищах, у культурах тканини або в експериментах на тваринах с зазвичай найдостовірнішим методом специфічної діагностики. Однак діагностична цінність досліджуваного методом посіву матеріалу значною мірою залежить від того, чи не був він забруднений супутньою мікробною флорою під час узяття і чи був доставлений у лабораторію з дотриманням умов, шо гарантують виживання вибагливих мікроорганізмів. Чутливість бактеріологічного методу залежить і від обсягу досліджуваного матеріалу. Так, для визрівання черевнотифозної сальмонели потрібно брата кров хворого і рідке середовище (10 % жовчний бульйон) у співвідношенні 1:10. Для виділення того чи іншого збудника можуть бути використані диференціально-діагностичні штучні поживні середовища (середовище з телуром для виділення коринебактерій, 1 % лужна пелтонна вода для виявлення вібріонів холери та ін.). Іноді для виділення певних збудників потрібні особливі умови культивування. Так, для виділення єрсиній необхідне так зване холодове пророщення — витримування поживного середовища, зараженого цими збудниками, за температури термостата 4 °С протягом 2—3 діб. Це пригнічує ріст інших мікробів, але спричиняє бурхливий розвиток єрсиній з утворенням колоній. Іноді потрібне тривале очікування через повільний ріст збудників — так, бруцели на яєчному штучному середовищі виростають до помітних колоній лише через І міс. культивування.

Вибір матеріалу для діагностики вірусних хвороб залежить як від стадії хвороби, так і від її клінічних проявів. Якщо хворого обстежують на ранніх стадіях захворювання, то часто вдається виявити вірус, використовуючи відповідно вірусологічний метод. Характер матеріалу, що підлягає вірусологічному дослідженню, і метод його транспортування до лабораторії деякою мірою залежать від етіології захворювання. Так, при діагностиці більшості вірусних інфекцій дихальних шляхів досить інформативними є мазки з гортанної частини горла. У зв’язку з надзвичайною лабільністю респіраторних вірусів мазки поміщають у буферні транспортні середовища з високим умістом протеїнів й антибіотиками. Якщо матеріал підлягає транспортуванню до іншої установи, його слід зберігати за температури —60 °С і перевозити в контейнері із сухим льодом. У хворих на вітряну віспу рідина, отримана з везикул, містить значну кількість вірусу і вірусного антигену. Посіви крові для виділення вірусів рідко сприяють діагностиці вірусних хвороб, за винятком арбовірусних інфекцій. Біопсія мозку’ — найефективніший метод діагностики енцефаліту, спричиненого вірусом простого герпесу. Біопсійний матеріал потрібно помістити у стерильний посуд із кришкою, що закручується, і

_______ ЗАГАЛЬНІ ПРИНЦИПИ ДІАГНОСТИКИ ІНФЕКЦІЙНИХ ХВ0Р06

зберігати в замороженому стані. Матеріал або вводять усередину курячого зародка, або контаміпують ним культури клітин чи тканин.

Іноді неможливо виділити збудника за допомогою поживних середовищ або клітинних чи тканинних культур. Тоді дуже часто проводять зараження різних лабораторних тварин (біологічний метод). Так, для виділення збудника лепри (вкрай вибагливого збудника) заражають американських броненосиів. Для виділення шигел проводять підкон’юнктивальне зараження ока кроля. При біологічному методі збудник може рости в різних органах залежно від способу зараження та подальшої його біохімічної, морфологічної та іншої ідентифікації. Такі методи використовують тільки в наукових цілях.

Для діагностики інфекційних хвороб широко використовують виявлення антитіл, антигенів, геномів збудника, побічних продуктів його життєдіяльності, Для виявлення специфічного для інфекційної хвороби результату контактування людини з мікроорганізмом, що призводить до імунної відповіді й вироблення антитіл, икористовують серологічний метод. Але наявність у сироватці крові хворого анти-ігіл, шо реагують із певним антигеном, вказує лише на те, що цей хворий мав контакт із антигеном. У зв’язку7 з цим клінічна інтерпретація серологічних тестів, за рідкісним винятком, залежить від результатів серійних визначень. Якщо титр антитіл значно підвищується або знижується, відповідну реакцію можна розцінювати як результат свіжого контакту з антигеном. У будь-якого хворого з неясним діагнозом узяту на початку дослідження стерильну пробу сироватки слід зберігати в замороженому стані для того, щоб за необхідності мати можливість порівняти її із сироваткою, отриманою в більш пізній період (так звані парні сироватки). Контакт з антигеном може виникати в результаті попередньої вакцинації або імунізації, що нерідко ускладнює інтерпретацію титрів сироваткових антитіл. Так звана анамнестична реакція, неспецифічна стимуляція антитіл до інших збудників при тій чи іншій інфекції, відбувається лише в разі антигенної подібності збудників, що може спричиняти певні діагностичні помилки, тому й потрібно проводити дослідження б парних сироватках для виявлення наростання титру антитіл до антигену справжнього збудника. Анамнестична реакція буде характеризуватися або монотонним титром, або його зниженням. Результати серологічних тестів слід інтерпретувати з урахуванням додаткової інформації про хворого, включаючи такі чинники, як попередні імунізації і перенесені захворювання, можливість впливу хімічних, але етіологічно чужих антигенів, наявність мінливого титру при постановці серійних реакцій па противагу7 однократному результату. Проти збудника макроорганізм виробляє різні групи антитіл (аглютиніни, опсоніни, комплементзв’язувальні, гемаглютиніни тощо), які відповідно виявляють у PA, РЗК, РГА, РИГА та ін. На жаль, під час проведення цих реакцій можливі несправжньопозитивні результати.

Натепер широко використовують 1ФА, який дає можливість розділити антитіла до антигенів збудника за класами IgM, IgG, що дає змогу диференціювати гострий процес (переважають IgM) від результатів вакцинації, хронічного перебігу7 або перенесеної інфекційної хвороби (переважають IgG). ІФА можна застосовувати і для візуального або спектрофотометричного виявлення мікробних антигенів. ELISA як варіант ІФА грунтується на тому, що специфічні моноклональні антитіла реагують із антивидовим кон’югантом, міченим ферментом. Після оброблення відповідним субстратом з’являється зміна забарвлення, яку можна побачити ПІД ЗВИЧаЙНЦМ’СБГЇПШЙМ ШКрОЩСОЦОЛК

17

ЗАГАЛЬНА ІНФЕКТОЛОПЯ

У діагностичному процесі застосовують низку технічних прийомів, спрямова-них на виявлення мікробних антигенів, геномів, побічних продуктів збудників. При використанні РІФ мазки, які припустімо містять віруси, бактерії, гриби або паразити, фарбують за допомогою препаратів, що включають готові специфічні моноклональні антитіла, мічені флюореснентними барвниками, і досліджують за допомогою люмінесцентного мікроскопа. Наприклад, РІФ мазків-відбитків із епітелію носової порожнини можна використовувати для екслресо-діагностики грипу, ГРВІ.

Зустрічний імуноелектрофорез — широко застосовуваний метод виявлення антигенів. У цьому варіанті дифузії матеріал, досліджуваний на наявність антигену, поміщають у канавку (лунку), зроблену в агарі, а специфічну антисироватку — в іншу (прилеглу) канавку. Потім через агар пропускають електричний струм, у результаті чого відбувається швидке, протягом кількох хвилин, зближення антигену й антитіла і злиття їх з утворенням преципітату. Реакцію аглютинації використовують з тією само метою, шо й зустрічний імуноелектрофорез, але вона характеризується більшою чутливістю, хоча можуть мати місце неслравжньопо зи -тивні результати, зумовлені термолабільними компонентами сироватки і ревматоїдним фактором.

РІА — високочутливий метод; при застосуванні доступних комерційних тест-наборів результати можна отримати протягом кількох годин. Суть методу: тестовий антиген, мічений радіоізотопом, конкурує з антигеном, що міститься у сироватці хворого, за специфічні антитіла в тест-суміші. Вільні та зв’язані антитіла видаляють відмиванням. Потім за допомогою гамма-лічильника аналізують реактивність комплексу антиген — антитіло.

Використання молекулярно-генетичних методів (ПЛР) і методу ампліфікації нуклеїнових кислот, або молекулярного клонування, уможливило виділення, репродукцію і маркування мікроорганізмів із суворо визначеним унікальним розташуванням нуклеотвдів у геномі, що представляють штам, вид, рід або групу. Перевага рекомбінантних ДНК-методів ампліфікації полягає в їхній унікальній специфічності, здатності виявляти єдиний патоген серед безлічі інших і, нарешті, ідентифікувати мікроорганізми, які або складно, або неможливо виявити іншими методами.

Імунохроматографічні (ІХГ) експрес-тєсти уможливлюють швидке визначення в пробі певних антигенів. На тест-смужках розчинні моноклональні антитіла до досліджуваного антигену кон’юговані з барвником, який можна легко ідентифікувати навіть у найменших концентраціях. Ці антитіла нанесені поблизу ділянки занурення тест-смужки у фізіологічну рідину (кров та ін.). За наявності в субстраті дослідження відповідного антигену з’являється видиме забарвлення. Зазначені тести можуть бути виконані особами, які мають мінімальну технічну кваліфікацію, усього за кілька хвилин. На цьому етапі розвитку медицини подібні дослідження мають певні недоліки, але їх широко використовують для скринінгового обстеження людей. Для підтвердження результату експрес-тестів у незрозумілих випадках використовують ПЛР та ін. Натепер такі тести застосовують для діагностики тропічної малярії, ВІЛ-інфекцїї, вірусних гепатитів тощо.

Газово-хроматографічний метод полягає в прямому дослідженні клінічних матеріалів за допомогою газорідинної хроматографії з метою виявити характерні побічні продукти метаболізму мікроорганізмів. Метод ефективний для диференціації аеробних і анаеробних мікроорганізмів у гною і крові.

ЗАГАЛЬНІ ПІДХОДИ ДО ЛІКУВАННЯ ІНФЕКЦІЙНИХ ХВОРОБ

Вплив антигенів певних типів різними шляхами і за обставин, не завжди повністю зрозумілих, призводить до розвитку негайної (анафілактичної, агонічної) або вповільненої гіперчутливості. У певних (далеко не у всіх) осіб активна інфекція деякими (але не всіма) бактеріями і вірусами призводить до розвитку гіпер-чутливості вповільненого типу. Клінічно цей алсргійний стан виявляють за допомогою внутрішньошкірного введення патогенного мікроорганізму або одного з його компонентів. У чутливого індивідуума на місці введення протягом 24—48 год з’являються ущільнення й еритема. Якщо індивідуум високочутливий або введена доза антигену надлишкова, може розвинутися виражене місцеве запалення з некрозом, формуванням везикул, набряком, регіонарною лімфадснопатією, нездужанням і гарячкою. Антигени, виготовлені в концентраціях, не здатних спричиняти тяжкі реакції, зазвичай використовують для внутрішньошкірних проб у діагностиці туберкульозу, венеричної лімфогранульоми, м’якого ншікра, бруцельозу, туляремії, сапа, бластомікозу, гістотитазмозу, кокцидіоїдозу та ііі. Імунна реакція на щеплення також є прикладом шкірної гіперчутливості вповільненого типу. Достовірність, специфічність та ефективність окремих тестів варіюють; ні питання обговорюються в розділах, присвячених певним інфекційним хворобам.

Іноді для виявлення токсинів як побічних продуктів мікроорганізму на лабораторних тваринах проводять нейтралізацію токсинів специфічними сироватками. Так, при ботулізмі білим мишам уводять сироватку крові, фільтрат блювотних мас, промивних вод шлунка хворого, у якого підозрюють це захворювання. Одночасно тваринам уводять специфічну антитоксичну сироватку. Якщо у патологічному матеріалі є відповідний сироватці токсин, відбувається знешкодження і миша залишається живою.

Інфекційні хвороби: підручник / За ред. О.А. Голубовської.